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プリンヌクレオシド化合物の製造方法
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- 【要約】
【課題】 酵素による核酸塩基の交換反応を利用して高収率でかつ安定的にプリンヌクレオシド化合物を得る方法を提供すること、及びウラシルチミンデヒドロゲナーゼ又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼを産生する微生物を提供すること。
【解決手段】 ピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基とをリン酸イオンを含む水溶液中において、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換させる反応において、生成するピリミジン塩基を微生物又は該微生物に由来する酵素によりピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質になり得ない化合物に変換することにより、プリンヌクレオシド化合物を得る。更に、本発明は、上記作用を有する新規微生物を提供する。
- 【特許請求の範囲】
【請求項１】 ピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換させる反応において、生成するピリミジン塩基を微生物又は該微生物に由来する酵素によりピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質になり得ない化合物に変換することを特徴とするプリンヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項２】 請求項１記載のプリンヌクレオシド化合物の製造方法において、塩基交換反応の際に生成する反応中間体であるリボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン酸の安定剤として、グリシン、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール（２−アミノエチルエーテル）四酢酸及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種以上の化合物とホウ酸又はその塩とを加えることを特徴とするプリンヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項３】 微生物が、アルスロバクター属、バチルス属、シュードモナス属及びロドコッカス属から選ばれる微生物である請求項１又は２記載のプリンヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項４】 ピリミジンヌクレオシド化合物が、ウリジン、デオキシウリジン、５−メチルウリジン及びチミジンからなる群より選択される化合物である請求項１又は２記載のプリンヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項５】 プリン塩基が、アデニン、グアニン、ベンズイミダゾール、ハロゲン化プリン及びアミノ化プリンからなる群より選択される化合物である請求項１又は２記載のプリンヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項６】 微生物に由来する酵素が、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼである請求項１又は２記載のプリンヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項７】 微生物が、アルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）、バチルス・メガテリウム ＹＧＫ ２５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０８）、シュードモナス・スピーシーズ ＹＧＫ ４４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０９）、ロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２、又はロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１９１である請求項１、２又は３記載のプリンヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項８】 ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼを産生する微生物であって、アルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）、バチルス・メガテリウム ＹＧＫ２５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０８）及びシュードモナス・スピーシーズ ＹＧＫ ４４３ （ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０９）よりなる群から選択される微生物。
- 【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵素による核酸塩基の交換反応を利用してプリンヌクレオシド化合物を高収率で製造する方法及び該製造に利用しうる酵素を産生する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、酵素による核酸塩基の交換反応を利用してヌクレオシド化合物を製造する方法が提案されているが、原料系と生成系の間に反応の平衡状態が生じ、これが収率の向上しない原因となっていた。この対策として、特開平４−１９７１９３号公報に、プリンヌクレオシドであるイノシン又は２’−デオキシイノシン（以下、デオキシイノシンという）とピリミジン塩基とをリン酸塩の水溶液中、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）により塩基を交換反応させ、この交換反応により生成したヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼにより尿酸に変化させることにより、反応収率を向上させる方法が開示されている。この場合、尿酸はこれらヌクレオシドホスホリラーゼの基質にはなり得ないので、反応はピリミジンヌクレオシドを生成する方向に一方的に進行する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、該公報に開示された方法は、原料としてイノシン又はデオキシイノシン及びピリミジン塩基を用いて、効率よくピリミジンヌクレオシドを製造する方法であり、より安価で入手しやすいピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基を原料とするプリンヌクレオシド化合物の製造方法ではない。ピリミジンヌクレオシド化合物を原料とする場合は、塩基交換反応により生成するピリミジン塩基を分解する酵素を反応系に加えることが平衡をずらし反応効率を向上させるために必須であるが、該酵素を天然物から活性の高い状態で製造したり、単離した事例は今まで報告されていなかった。すなわち、ピリミジンヌクレオシド化合物を原料とするプリンヌクレオシド化合物の高収率の製造方法は見い出されていなかった。したがって、安定に高収率でプリンヌクレオシド化合物を製造する方法が強く望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上述の問題点を解決すべく、ピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基との交換反応の際に生じるピリミジン塩基をピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質となり得ない化合物へ変換する酵素を産生する微生物を鋭意探索した結果、アルスロバクター属、バチルス属、シュードモナス属、又はロドコッカス属に属する微生物が該酵素を産生しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明の第一は、ピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換させる反応において、生成するピリミジン塩基を微生物又は該微生物に由来する酵素によりピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質になり得ない化合物に変換することを特徴とするプリンヌクレオシド化合物の高収率製造法である。
【０００６】また、本発明の第二は、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼを産生する微生物であって、アルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）、バチルス・メガテリウムＹＧＫ ２５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０８）及びシュードモナス・スピーシーズ ＹＧＫ ４４３ （ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０９）よりなる群から選択される微生物である。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明する。まず、第一の発明について説明する。第一の発明は、ピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換させる反応において、生成するピリミジン塩基を微生物又は該微生物に由来する酵素によりピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質になり得ない化合物に変換することを特徴とするプリンヌクレオシド化合物の製造方法である。
＜原料＞本発明の原料として用いられるピリミジンヌクレオシド化合物は、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの作用を受け、生成したピリミジン塩基が使用する分解酵素の作用を受けるものであれば、天然型、非天然型を問わず、特に制限されない。例えば、ウリジン、デオキシウリジン、５−メチルウリジン、チミジンが挙げられ、その他の非天然型ピリミジンヌクレオシド及び非天然型デオキシピリミジンヌクレオシドも含まれる。
【０００８】本発明に用いられるプリン塩基は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼの作用を受けるものであれば特に制限されない。例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチンなどの天然型プリン塩基、ベンズイミダゾール、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリンなどのアミノ化プリン、２−クロロプリン、６−クロロプリン、２，６−ジクロロプリン、２−アミノ−６−クロロプリンなどのハロゲン化プリン、及び６−メルカプトプリン、６−メチルチオプリンなどのチオ化プリンなどの非天然型プリン塩基が挙げられる。
＜微生物及び酵素＞本発明に用いられるプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼは、原理的にはいかなる起源のものでも構わない。
【０００９】本発明で用いられる、ピリミジン塩基を分解する微生物由来の酵素としては、塩基交換反応により生成したピリミジン塩基をピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質になり得ない化合物に変換する酵素であれば、特に制限されない。例えば、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．９９．１）、ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．１．１）などが挙げられる。特に、後述する本発明の微生物により産生される酵素、及びロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２、又はロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１９１から産生される酵素が好ましい。
【００１０】本明細書において、微生物又は該微生物に由来する酵素によりとは、微生物を含有する懸濁液（菌体懸濁液）、又は該微生物から産生される酵素を用いてピリミジン塩基の分解反応を行うことを意味する。即ち、本発明は、微生物を含有する菌体懸濁液そのものを用いてピリミジン塩基の分解反応を行ってもよく、また微生物から産生される酵素を取り出して該反応を行ってもよい。
＜リボース−１−リン酸の安定剤＞本発明において、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼとプリンヌクレオシドホスホリラーゼによる塩基交換反応は中間体としてリボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン酸の糖誘導体を経由する。これら中間体は本来不安定であり、放置すると経時的にリボース又はデオキシリボースのような糖とリン酸イオンに分解するが、反応系中にホスファターゼが存在すると、中間体の加水分解はさらに加速される。中間体の分解生成物であるリボース又はデオキシリボースのような糖はこれらヌクレオシドホスホリラーゼの基質とはならないため、プリンヌクレオシド又はデオキシプリンヌクレオシドの生成量は減少する。そこで、これらプリンヌクレオシド化合物の生成効率を上げるために、リボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン酸のような糖誘導体を安定化し、ホスファターゼの活性を阻害する物質を鋭意探索した。その結果、ある種の錯体形成化合物の組み合わせが有効であることを見い出した。
【００１１】すなわち、グリシン、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（略称ＥＤＴＡ）、エチレングリコール（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（略称ＥＧＴＡ）及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種以上の化合物とほう酸又はその塩との組み合わせが有効であることを見い出した。特に、ホウ酸とエチレンジアミン四酢酸の組み合わせが著しい効果を示す。
＜反応条件と分離・精製＞次に、反応条件について記す。本発明において、原料のピリミジンヌクレオシド化合物の初期濃度は５〜３００ｍＭであり、好ましくは１０〜５０ｍＭである。プリン塩基は一般に難溶性であるが、初期添加量が全て溶解すると仮定して表記すると、初期濃度は５〜３００ｍＭであり、好ましくは１０〜５０ｍＭである。リン酸イオンの初期濃度は１〜２０ｍＭであれば十分である。また、ヌクレオシドとプリン塩基は通常は同一の初期濃度で用いる。一般にリン酸イオンに対するヌクレオシドの濃度比は大きい方が目的物のプリンヌクレオシド化合物の収率は増大する。
【００１２】また、安定剤として使用する錯体形成化合物において、ホウ酸又はその塩の使用量は、５〜２００mMであり、好ましくは５０〜１００mMであり、組み合わせの一方であるＥＤＴＡ又はその塩などの使用量は２〜１２mMであり、好ましくは４〜６mMである。
【００１３】反応液のｐＨは６．５〜１０．５であり、好ましくは７．０〜８．０である。反応温度は３５〜６０℃であり、好ましくは３５〜４５℃である。なお、反応液からの生成物の採取は、晶析やクロマトグラフィーなどにより行うことができる。
【００１４】以下に本発明の製造方法の原理を説明する。
＜本発明の原理・理論＞（１）本発明の第一段階では、リン酸イオンの存在下で、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、ピリミジンヌクレオシド化合物とリン酸イオンから、ピリミジン塩基とリボース−１−リン酸又は２−デオキシリボース−１−リン酸のような糖の１位にリン酸イオンの結合した糖誘導体（以下、単に糖誘導体という。）が生成する。
【００１５】（２）次に、第二段階として、生成した糖誘導体が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、プリン塩基と置換反応を行う。これにより、糖誘導体とプリン塩基との反応からプリンヌクレオシド化合物とリン酸イオンが生成する。
【００１６】（１）と（２）の反応を整理すると、ピリミジンヌクレオシドとプリン塩基を用いてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、塩基交換反応を行い、ピリミジン塩基とプリンヌクレオシド化合物が生成する。
【００１７】（３）次に、本発明では、反応系に、ピリミジン塩基をピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質となり得ない化合物に変換する酵素又はこれらを産生する微生物を含有する。本発明では、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ、又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼのような酵素又はこれらを産生する微生物を用いることが好ましいが、これに限定されない。本発明の製造方法では、上記酵素又はこれらを産生する微生物と、電子受容体を共存させることにより、ピリミジ塩基を、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質となり得ない化合物に変換する。なお、菌体懸濁液を反応系に用いる際は、菌体内に電子受容体が含まれているため、電子受容体を反応系にあえて加えなくてもよい。変換されたピリミジン塩基は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの基質にはなり得ないので、基質の交換反応には関与せず反応系から除外される。これにより、反応の平衡を目的物のプリンヌクレオシド化合物が生成する側へ移動させ、目的物が高収率で得られる。
【００１８】（４）さらに、必要な場合には、以下の好ましい態様で具体的に説明するように、変換された化合物を更に分解する酵素が含まれていてもよい。次に、本発明の製造方法を具体例で説明する。
【００１９】本発明の好ましい態様では、原料のピリミジンヌクレオシド化合物としてウリジン又は２’−デオキシウリジン（以下、デオキシウリジンという）を、核酸塩基としてプリン塩基を、酵素としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びウラシルチミンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．９９．１）を用いる。
【００２０】（１）まず、第一段階として、リン酸イオンの存在下で、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、ウリジン又はデオキシウリジンとリン酸イオンから、ウラシルとリボース−１−リン酸又は２−デオキシリボース−１−リン酸（以下、デオキシリボース−１−リン酸という）が生成する。
【００２１】（２）次に、第二段階として、生成したリボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン酸が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、プリン塩基と置換反応を行う。これにより、リボース−１−リン酸とプリン塩基との反応からプリンヌクレオシドとリン酸イオンが生成し、デオキシリボース−１−リン酸とプリン塩基との反応からは２’−デオキシプリンヌクレオシド（以下、デオキシプリンヌクレオシドという）とリン酸イオンが生成する。
【００２２】（１）と（２）の反応を整理すると、ウリジン又はデオキシウリジンとプリン塩基を用いてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、塩基交換反応を行い、ウラシルとプリンヌクレオシド又はデオキシプリンヌクレオシドが生成する。
【００２３】（３）反応系にウラシルチミンデヒドロゲナーゼ、又はウラシルチミンデヒドロゲナーゼとＮＡＤなどの電子受容体（酸化型）を共存させることにより、ウリジン又はデオキシウリジンの分解で生成したウラシルは不可逆的にバルビツール酸となる。生成したバルビツール酸は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの基質にはなり得ないので、基質の交換反応には関与せず反応系から除外される。これにより、反応の平衡を目的物のプリンヌクレオシド化合物が生成する側へ移動させ、目的物が高収率で得られる。
【００２４】（４）さらに、反応系にバルビツラーゼ（ＥＣ３．５．２．１）を存在させることによりバルビツール酸が尿素とマロン酸に分解される。これにより、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼによる変換反応が促進される。
【００２５】例えば、出発原料のピリミジンヌクレオシド化合物としてデオキシウリジンを、プリン塩基としてグアニンを用いて、目的物のプリンヌクレオシド化合物として２’−デオキシグアノシン（以下、デオキシグアノシンという）を得る場合は次のようになる。
【００２６】
【化１】【００２７】但し、ＰＹＮＰはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを表し、ＰＵＮＰはプリンヌクレオシドホスホリラーゼを表し、Ｐｉはリン酸イオンを表す。（１）と（２）から次式が成り立つ。
【００２８】
【化２】但し、ＰＹＮＰ及びＰＵＮＰは先に定義したとおりである。
【００２９】
【化３】【００３０】
【化４】【００３１】本発明の他の好ましい態様では、ピリミジンヌクレオシド化合物としてウリジン又はデオキシウリジン、核酸塩基としてプリン塩基を、酵素としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．１．１）を用いる。
【００３２】（１）ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、ウリジン又はデオキシウリジンとリン酸イオンから、ウラシルとリボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン酸が生成する。
【００３３】（２）次に、生成したリボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン酸が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、プリン塩基と置換反応を行う。これにより、リボース−１−リン酸とプリン塩基との反応からプリンヌクレオシドとリン酸イオンが生成し、デオキシリボース−１−リン酸とプリン塩基との反応からはデオキシプリンヌクレオシドとリン酸イオンが生成する。
【００３４】（１）と（２）の反応を整理すると、ウリジン又はデオキシウリジンとプリン塩基を用いてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、塩基交換反応を行い、プリンヌクレオシド又はデオキシプリンヌクレオシドとウラシルが生成する。
【００３５】（３）反応系にジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ、又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼとＮＡＤＨなどの電子受容体（還元型）とを共存させることにより、ウリジン又はデオキシウリジンの分解で生成したウラシルは不可逆的にジヒドロウラシルとなる。生成したジヒドロウラシルは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの基質にはなり得ないので、基質の交換反応には関与せず反応系から除外される。これにより、反応の平衡を目的物のプリンヌクレオシド化合物が生成する側へ移動させ、目的物が定量的に得られる。
【００３６】（４）さらに、反応系にジヒドロピリミジナーゼ（ＥＣ３．５．２．２）が存在することによりジヒドロウラシルがＮ−カルバモイル−β−アラニンに分解される。これにより、ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼの反応が促進される。
【００３７】例えば、出発原料のピリミジンヌクレオシド化合物としてデオキシウリジンを、プリン塩基としてアデニンを用いて、目的物のプリンヌクレオシド化合物として２’−デオキシアデノシン（以下、デオキシアデノシンという）を得る場合は次のようになる。
【００３８】
【化５】但し、ＰＹＮＰ、ＰＵＮＰ及びＰｉは先に定義したとおりである。（１）と（２）から次式が成り立つ。
【００３９】
【化６】但し、ＰＹＮＰ及びＰＵＮＰは先に定義したとおりである。
【００４０】
【化７】【００４１】
【化８】【００４２】次に、第二の発明について説明する。第二の発明は、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼを産生する微生物であって、アルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）、バチルス・メガテリウム ＹＧＫ２５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０８）及びシュードモナス・スピーシーズ ＹＧＫ ４４３ （ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０９）よりなる群から選択される微生物である。
＜酵素生産微生物及びその同定＞本発明者はピリミジン塩基をピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質になり得ない化合物に変換する一連の酵素の一つ又はそれ以上を、次の微生物が生産することを見出した。
【００４３】すなわち、これら微生物は、（１）ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ、（２）ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ、（３）ウラシルチミンデヒドロゲナーゼとバルビツラーゼ（ＥＣ３．５．２．１）、及び（４）ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼとジヒドロピリミジナーゼ（ＥＣ３．５．２．２）の群より選ばれる少なくとも一種以上の酵素を産生する。
＜培養条件と酵素の調製＞これら微生物は通常の細菌用培地によく生育し、該酵素を生産するが、培地にピリミジン塩基を添加することは、酵素活性を高めるうえで有効である。
【００４４】培養した菌体はそのまま粗酵素として利用することが可能であるが、常法により粗酵素を得てこれを用いることもできる。
アルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．） ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） ＹＧＫ ２５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０８）
シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＹＧＫ４４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０９）
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ） ＪＣＭ ３１３２ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ） ＪＣＭ ３１９１ＪＣＭは理化学研究所微生物系統保存施設の保存菌株であることを示す。その他の菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されている。これら寄託菌株の菌学的性質を、バージェイス・マニュアル・オブ・デターミナティブ・バクテリオロジー第８版（１９７５年）、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第１巻（１９８４年）及び第２巻（１９８６年）に準じて検討した結果は次のようである。なお、実験は主として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」（学会出版センター、１９８５年）記載の方法により行った。
【００４５】アルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２１．形態的性質（１）細胞の大きさ： ０．５〜０．７×１．０〜５．０μｍの桿菌（２）グラム染色性： 陽性（３）細胞の多形性： 生活環に伴う球菌〜桿菌の顕著な多形性が見られる。
（４）運動性：有り（酵母エキス加肉汁液体培地で５〜２４時間培養に運動性が見られる）
（５）鞭毛の着生状態：有り、１〜２本の側毛（６）胞子の有無： 無し（７）抗酸性： 無し２．培養的性質（１）肉汁寒天平板培養：３０℃、２４時間培養で乳白色、半透明、表面がザラザラの円形、波状のコロニ−を形成する。
（２）肉汁寒天斜面培養：淡黄色、半透明で培地全体に拡がり生育は良好である。
（３）肉汁液体培養：生育が遅い。酵母エキスを添加した振とう培養で良好な生育が見られる。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 表面のみわずかに液化する。
（５）リトマスミルク： 変化しない３．生理学的性質（１）硝酸塩の還元 陰性（２）脱窒反応 陰性（３）ＭＲテスト 陰性（４）ＶＰテスト 陰性（５）インドールの生成 陰性（６）硫化水素の生成 陰性（７）クエン酸の利用・クリステンセン培地 陰性・コーザーの培地 陰性（８）無機窒素源の利用・硝酸塩 陽性・アンモニウム塩 陰性（９）色素の生成 無し（10）ウレアーゼ 陰性（11）オキシダーゼ 陰性（12）カタラーゼ 陽性（13）生育の範囲・ｐＨ域 ５．５〜９．５・温度域 １９〜３８℃（14）酸素に対する態度 好気性（15）Ｏ−Ｆテスト・グルコ−ス 変化無し・サッカロ−ス 変化無し（16）各種炭素源の利用・Ｌ−アラビノ−ス ±・Ｄ−キシロ−ス ＋・Ｄ−グルコ−ス ＋・Ｄ−マンノ−ス ＋・Ｄ−フラクト−ス ＋・Ｄ−ガラクト−ス ＋・マルトース ＋・スクロース ＋・ラクトース −・トレハロ−ス ＋・Ｄ−ソルビトール ＋・Ｄ−マンニトール ＋・イノシトール ＋・グリセリン −・デンプン −４．ＧＣ含量（ＨＰＬＣ法による）
Ｇ＋Ｃ（ｍｏｌ％）＝６９．６以上の菌学的性質に基づき、本菌株はアルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｓｐ．）に属することが判明した。
【００４６】バチルス・メガテリウム ＹＧＫ ２５２１．形態的性質（１）細胞の大きさ： １．６×４．０〜９．０μｍの桿菌（２）グラム染色性： 陽性（３）細胞の多形性： 無し（４）運動性： 有り（５）鞭毛の着生状態：有り、周毛（６）胞子の有無： 有り、胞子嚢は膨らまない、胞子の形は楕円形（７）抗酸性： 無し２．培養的性質（１）肉汁寒天平板培地：３０℃、２４時間培養で乳白色、不透明、表面がザラザラな円形波状のコロニ−を形成する。
（２）肉汁寒天斜面培地：淡黄色、不透明で表面が乾き気味、周辺がギザギザとしてストロ−クに沿って良好に生育する。
（３）肉汁液体培地： 生育が遅く、酵母エキスを加えると生育が良好になる。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 表面のみ液化する。
（５）リトマスミルク： やや酸性となり、凝固が見られる。
３．生理学的性質（１）硝酸塩の還元 陽性（２）脱窒反応 陽性（３）ＭＲテスト 陽性（４）ＶＰテスト 陰性（５）インドールの生成 陰性（６）硫化水素の生成 陰性（７）クエン酸の利用・クリステンセン培地 陽性・コーザーの培地 陽性（８）無機窒素源の利用・硝酸塩 陽性・アンモニウム塩 陽性（９）色素の生成 無し（10）ウレアーゼ 陽性（11）オキシダーゼ 陽性（12）カタラーゼ 陽性（13）生育の範囲・ｐＨ域 ５．５〜１０．５・温度域 １０〜４３℃（14）酸素に対する態度 好気性（15）Ｏ−Ｆテスト・グルコ−ス 変化無し・サッカロ−ス 変化無し（16）各種炭素源の利用・Ｌ−アラビノ−ス −・Ｄ−キシロ−ス −・Ｄ−グルコ−ス −・Ｄ−マンノ−ス −・Ｄ−フラクト−ス −・Ｄ−ガラクト−ス −・マルトース −・スクロース −・ラクトース −・トレハロ−ス −・Ｄ−ソルビット −・Ｄ−マンニット −・イノシット −・グリセリン −・デンプン ＋４．ＧＣ含量（ＨＰＬＣ法による）
Ｇ＋Ｃ（ｍｏｌ％）＝３４．７以上の菌学的性質に基づき、本菌株はバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）であることが判明した。
【００４７】シュ−ドモナス・スピ−シ−ズ ＹＧＫ ４４３１．形態的性質（１）細胞の大きさ： ０．４〜０．６×０．６〜２．４μｍの桿菌（２）グラム染色性： 陰性（３）細胞の多形性： 無し（４）運動性： 有り（５）鞭毛の着生状態：有り、４〜５本の極鞭毛（６）胞子の有無： 無し（７）抗酸性： 陰性２．培養的性質（１）肉汁寒天平板培養：３０℃、２４時間培養で乳白色、半透明、表面が滑らかな円形のコロニ−を形成する。
（２）肉汁寒天斜面培養：乳白色、半透明で光沢があり、生育はストロ−クに沿って良好に生育する。
（３）肉汁液体培養： 振とう培養で良好な生育が見られる。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 変化無し（５）リトマスミルク： アルカリ性、ペプトン化しない。
３．生理学的性質（１）硝酸塩の還元 陽性（２）脱窒反応 陰性（３）ＭＲテスト 陰性（４）ＶＰテスト 陰性（５）インドールの生成 陰性（６）硫化水素の生成 陰性（７）クエン酸の利用・クリステンセン培地 陽性・コーザーの培地 陽性（８）無機窒素源の利用・硝酸塩 陽性・アンモニウム塩 陽性（９）蛍光性色素の生成 無し（10）ウレアーゼ 陽性（11）オキシダーゼ 陽性（12）カタラーゼ 陽性（13）生育の範囲・ｐＨ域 ４．２〜１０．５・温度域 １７〜４３℃（14）酸素に対する態度 好気性（15）Ｏ−Ｆテスト・グルコ−ス Ｏ（酸化的）
・サッカロ−ス 変化無し（16）アルギニンの分解 陰性（17）各種炭素源の利用・Ｌ−アラビノ−ス ＋・Ｄ−キシロ−ス ＋・Ｄ−グルコ−ス ＋・Ｄ−マンノ−ス ＋・Ｄ−フラクト−ス ＋・Ｄ−ガラクト−ス ＋・マルトース ＋・スクロース ＋・ラクトース −・トレハロ−ス ＋・Ｄ−ソルビット −・Ｄ−マンニット ＋・イノシット ＋・グリセリン ＋・デンプン −４．ＧＣ含量（ＨＰＬＣ法による）
Ｇ＋Ｃ（ｍｏｌ％）＝６２．３以上の菌学的性質に基づき、本菌株はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．）に属することが判明した。
【００４８】
【実施例】以下、製造例、実験例、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
製造例１ プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを含む菌体懸濁液の調製プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下、ＰＵＮＰという）とピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下、ＰＹＮＰという）の生産菌であるバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ＪＴＳ ８５９（ＦＥＲＭ Ｐ−９６６６）を、次の手順で培養した。
【００４９】菌の培養には、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、グルコース３ｇ、食塩３ｇ、イノシン１ｇ及び水１ＬよりなるｐＨ６．２の培地を用いた。この培地１．５Ｌにバチルス・ステアロサーモフィルス ＪＴＳ ８５９（ＦＥＲＭ Ｐ−９６６６）の胞子３×１０7 個を添加し、撹拌翼（直径７０ｍｍ、上下各１枚）を有する３Ｌ容ジャーファーメンターを用い、撹拌翼を５００ｒｐｍで回転させつつ、通気量１ｖｖｍ、培養温度６５℃、ｐＨ６．０〜６．４で５時間培養した。
【００５０】培養終了後、菌体を遠心分離（１０，０００Ｇ、４℃、１５分）により集め、得られた湿菌体２０ｇを１０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ７）３０ｍｌに懸濁したものをプリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを含む菌体懸濁液（以下、ＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ酵素液という）とした。
製造例２ ウラシル及びチミン分解活性を有する菌体懸濁液の調製ウラシル及びチミン分解活性を有するアルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）、バチルス・メガテリウム ＹＧＫ２５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０８）、シュードモナス・スピーシーズ ＹＧＫ４４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０９）、ロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２、又はロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１９１の菌体懸濁液を次の手順で調製した。
【００５１】菌の培養には、ウラシル２ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、リン酸水素二カリウム３ｇ、酵母エキス６ｇ及び水１ＬよりなるｐＨ７．０の培地を用いた。この培地各５００ｍｌを入れた２Ｌ容の三角フラスコに上記の微生物の菌体又は胞子をそれぞれ３×１０7 個づつ接種し、２００ｒｐｍで回転させつつ、温度３５℃で１５時間培養した。
【００５２】培養終了後、菌体を遠心分離（１０，０００Ｇ、４℃、１５分）により集め、得られた湿菌体を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）６ｍｌに懸濁したものを、菌体懸濁液（以下、ウラシル・チミン分解酵素液という）とした。
実験例１ 微生物によるウラシル及びチミン分解酵素の生産５０ｍＭウラシル又は５０ｍＭチミンのいずれか一方、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）及び製造例２で調製した各菌株由来のウラシル・チミン分解酵素液のいずれか一つを０．０５ｍｌ含む全量１ｍｌの反応液を、３５℃で１５分間反応させ、反応液中のウラシル及びチミン分解活性を高速液体クロマトグラフィーで定量分析した。その結果を表１に示す。なお、ここで分解活性Ｕは、３５℃において、１分間当たり１μｍｏｌの基質（ウラシル又はチミン）を分解する酵素活性の量である。
【００５３】
【表１】実験例２ ウラシル・チミン分解酵素生産菌の生産酵素５０ｍＭウラシル、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）及び製造例２で調製した各菌株由来のウラシル・チミン分解酵素液のいずれか一つを０．０５ｍｌ含む全量１ｍｌの反応液を、３５℃で１５〜３０分反応させた。反応液中のウラシルチミンデヒドロゲナーゼ、バルビツラーゼ、ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ及びジヒドロピリミジナーゼの存在を、バルビツール酸及びジヒドロウラシルの生成と消失を高速液体クロマトグラフィーで追跡することにより検出した。その結果を表２に示す。＋は酵素の検出を表し、−は検出できなかったことを表す。
【００５４】この場合、例えば、ジヒドロピリミジナーゼの活性がジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼの活性より強ければ、生成物ジヒドロウラシルは検出されない。したがって、表２の−印は必ずしも該酵素の存在を１００％否定するものではない。
【００５５】
【表２】実施例１ ＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ酵素液とウラシル・チミン分解酵素液によるプリンヌクレオシドの製造２０ｍＭチミジン、２０ｍＭグアニン、１．２５ｍＭリン酸カリウム、製造例１で調製したＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ酵素液２ｍｌ、製造例２で調製したアルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２由来のウラシル・チミン分解酵素液０．５ｍｌ、１００ｍＭホウ酸と４ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む、全量１００ｍｌの水溶液（ｐＨ７）を、３５℃で１１０時間反応させ、反応液中に含まれる基質及び生成物の濃度を測定した。その結果を図１に示す。
【００５６】また、ウラシル・チミン分解酵素液を添加しないこと以外は、全て上記と同一の条件で反応を行い、反応液中に含まれる基質及び生成物の濃度を測定した。その結果を図２に示す。
【００５７】図１及び図２において、白抜きの四角はチミジン、黒塗りの菱形はデオキシグアノシン、黒塗りの三角はチミン、白抜きの三角は５−メチルバルビツール酸を表す。
【００５８】図１では、５−メチルバルビツール酸の生成が認められ、更にこの酸が分解消失することから、このウラシル・チミン分解酵素液中には少なくともウラシルチミンデヒドロゲナーゼ及びバルビツラーゼが存在することが判明した。この場合（図１）では、原料のグアニンは微かに残存が認められたが、チミジンはほぼ消失した。デオキシグアノシンは１４．９ｍＭ（収率７５％）生成した。ウラシル・チミン分解酵素液が存在しない場合（図２）と比較すると、目的物のデオキシグアノシンの生成量が非常に高いことが分かる。
実施例２〜１１ 種々の原料ヌクレオシドと種々の原料プリン塩基を用いたプリンヌクレオシドの製造表３に示すピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基を用いた以外は、実施例１と同様の条件で３５℃で、９０時間反応させた。反応液中に含まれる基質及び生成物の濃度を定量した結果を表３に示す。なお、ウラシル・チミン分解酵素液の代わりに蒸留水０．５ｍｌを加えた以外は上記と同様の条件で反応させたものを対照とした。ウラシル・チミン分解酵素液の添加により、プリンヌクレオシド化合物の収率が向上し、特にその効果はグアノシン及びデオキシグアノシンの生成において顕著であった。
【００５９】
【表３】実施例１２ 各菌株由来ウラシル・チミン分解酵素液のプリンヌクレオシド化合物生成に対する効果２０ｍＭチミジン、２０ｍＭグアニン、１．２５ｍＭリン酸カリウム、製造例１で調製したＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ酵素液２ｍｌ、製造例２で調製した各菌株由来のウラシル・チミン分解酵素液０．５ｍｌ、１００ｍＭホウ酸と４ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む、全量１００ｍｌの溶液（ｐＨ７）を調製した。なお、ウラシル・チミン分解酵素液の代わりに蒸留水０．５ｍｌを加えた以外は上記と同様の条件で反応させたものを対照とした。
【００６０】これらの液を３５℃で１００時間反応させ、反応液中に含まれる基質及び生成物の濃度を測定した。その結果を表４に示す。いずれの菌株由来のウラシル・チミン分解酵素液もデオキシグアノシン生成の効率を高めることが確認された。
【００６１】
【表４】実施例１３ 反応中間体（リボース−１−リン酸）の安定化とホスファターゼによる分解の阻害５ｍＭリボース−１−リン酸、表５に示す安定剤（ＥＤＴＡは４ｍＭ、その他は１００ｍＭ濃度で使用）、製造例１で調製したＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ酵素液０．０２ｍｌ、製造例２で調製したアルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２由来のウラシル・チミン分解酵素液０．０１ｍｌを含む、全量１ｍｌの水溶液（ｐＨ７）を、３５℃で７２時間反応させ、反応液中に含まれるリボース−１−リン酸と分解生成物のリボースを薄層クロマトグラフィーにより測定した結果を表５に示す。測定法はＩｓｈｉｉらの方法（Ａｇｒｉｃ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ.,５３（１２）、３２０９〜３２１８（１９８９））によった。なお、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（以下、トリスという）１００ｍＭを加え両酵素液を加えない以外は上記と同様に調製した液をトリス（対照）とした。なお、表中の＋はリボース−１−リン酸の分解ありを、−は分解なしを表す。
【００６２】酵素液の添加なしのトリス（対照）では、分解はさほど進行しないことから、酵素液の中にはホスファターゼが含まれていることが分かる。ホウ酸とＥＤＴＡ添加液ではリボース−１−リン酸の分解が認められなかったことから、これら物質が酵素液中のホスファターゼ活性を阻害し、またリボース−１−リン酸の安定化に寄与していることが分かる。
【００６３】
【表５】実施例１４ デオキシグアノシンの生成に対する安定剤の効果２０ｍＭチミジン、２０ｍＭグアニン、表６に示す安定剤（表中における＊は４ｍＭ、その他は１００ｍＭ濃度を表す）、１．２５ｍＭリン酸カリウム、製造例１で調製したＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ酵素液、製造例２で調製したアルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２由来のウラシル・チミン分解酵素液０．５ｍｌを含む、全量１００ｍｌの水溶液（ｐＨ７）を、３５℃で９０時間反応させた。反応液中に含まれるデオキシグアノシンの濃度を定量した結果を表６に示す。これらの結果から、実施例１３で見られたホウ酸とＥＤＴＡ類似の錯体形成化合物との組み合わせが、リボース−１−リン酸の分解阻害と安定化効果をもたらし、プリンヌクレオシド化合物の生成効率を高めることが証明された。
【００６４】
【表６】【００６５】
【発明の効果】本発明の核酸塩基の交換反応を利用したプリンヌクレオシド化合物の製造方法により、安価で入手しやすいピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基を原料として、プリンヌクレオシド化合物を高収率でかつ安定的に製造することが可能となった。
- 【公開番号】特開平１１−４６７９０
【公開日】平成１１年（１９９９）２月２３日
【発明の名称】プリンヌクレオシド化合物の製造方法
【発明者】
【氏名】三上 洋一
【氏名】松本 清一郎
【氏名】吉中 信二
【氏名】須永 陽之助
【氏名】長谷川 綾美
- 【出願番号】特願平９−２０９１３３
【出願日】平成９年（１９９７）８月４日
【出願人】
【識別番号】０００２４６３９８
【氏名又は名称】有機合成薬品工業株式会社
- 【代理人】
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴江 武彦 （外５名）
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