新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加した食品、その製造方法、非う蝕性食品組成物、及びビフィズス菌増殖組成物
スポンサード リンク
- 【要約】
【課題】新規な構造を持つオリゴ糖を提供し、ピラノース型でフルクトース転移活性を有する酵素の反応を利用して新規オリゴ糖の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明の新規オリゴ糖は、下記一般式（１）で表される化合物。
（式中、Ｒ1 は、水素原子、又は位置番号３で結合するグルコース、Ｒ2 は、水素原子、又は位置番号１で結合するグルコースを表し、Ｒ1 とＲ2 は同時にグルコースではない。）
スポンサード リンク
- 【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるオリゴ糖。
【化１】
（式中、Ｒ1 は、水素原子、又は位置番号３で結合するグルコース、Ｒ2 は、水素原子、又は位置番号１で結合するグルコースを表す。）
【請求項２】
請求項１記載のオリゴ糖が、下記式（２）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｄ−グルコピラノース。
【化２】
【請求項３】
請求項１記載のオリゴ糖が、下記式（３）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ο−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）−Ｄ−グルコピラノース。
【化３】
【請求項４】
請求項１記載のオリゴ糖が、下記式（４）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ο−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］−Ｄ−グルコピラノース。
【化４】
【請求項５】
１０質量％以上８０質量％以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成し、該溶液から該オリゴ糖を得ることを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
前記β−フルクトフラノシダーゼが、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製β−フルクトフラノシダーゼである請求項５記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項７】
１０質量％以上８０質量％以下の糖質を含む培地に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、培地中に請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させ、該培地中からオリゴ糖を採取することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項８】
前記糖質が、グルコース及びフルクトースを含むものである請求項５乃至７の何れか１項に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項９】
前記糖質が、ラミナリビオース及びフルクトースを含むものである請求項５乃至７の何れか１項に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物が酵母及び乳酸菌から選ばれた１種以上である請求項６又は７に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１１】
前記酵母が、Saccharomyces 属に属する微生物又はPichia属に属する微生物ある請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１２】
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeに属する微生物である請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１３】
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeＪＣＭ１４９９である請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１４】
前記酵母が、Pichia anomalaに属する微生物である請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１５】
前記酵母が、Pichia anomala Ｆｅｒｍ ＡＰ−２０５０４ である請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１６】
前記酵母が、Pichia anomala ＪＣＭ３５８５である請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１７】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させ、生成されたオリゴ糖を採取することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項１８】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項１９】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスにβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項２０】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製酵素を作用させることにより、請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項２１】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、該抽出エキス中に請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項２２】
請求項１８乃至２１の何れか１項から選ばれた製造方法により得られた食品。
【請求項２３】
請求項１又は２に記載のオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とするビフィズス菌増殖用組成物。
【請求項２４】
請求項１又は２に記載のオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする非う蝕性組成物。
【請求項２５】
請求項１、２、３及び４に記載のオリゴ糖から選ばれた１種以上のオリゴ糖を添加してなる飲食品。
【請求項２６】
請求項１、２、３及び４に記載のオリゴ糖から選ばれた１種以上のオリゴ糖を添加してなる飼料。【請求項１】
下記一般式（１）で表されるオリゴ糖。
【化１】
（式中、Ｒ1 は、水素原子、又は位置番号３で結合するグルコース、Ｒ2 は、水素原子、又は位置番号１で結合するグルコースを表し、Ｒ1 とＲ2 は同時にグルコースではない。）
【請求項２】
請求項１記載のオリゴ糖が、下記式（２）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｄ−グルコピラノース。
【化２】
【請求項３】
請求項１記載のオリゴ糖が、下記式（３）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ο−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）−Ｄ−グルコピラノース。
【化３】
【請求項４】
請求項１記載のオリゴ糖が、下記式（４）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ο−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］−Ｄ−グルコピラノース。
【化４】
【請求項５】
１０質量％以上８０質量％以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成し、該溶液から該オリゴ糖を得ることを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
前記β−フルクトフラノシダーゼが、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製β−フルクトフラノシダーゼである請求項５記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項７】
１０質量％以上８０質量％以下の糖質を含む培地に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、培地中に請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させ、該培地中からオリゴ糖を採取することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項８】
前記糖質が、グルコース及びフルクトースを含むものである請求項５乃至７の何れか１項に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項９】
前記糖質が、ラミナリビオース及びフルクトースを含むものである請求項５乃至７の何れか１項に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物が酵母及び乳酸菌から選ばれた１種以上である請求項６又は７に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１１】
前記酵母が、Saccharomyces 属に属する微生物又はPichia属に属する微生物ある請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１２】
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeに属する微生物である請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１３】
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeＪＣＭ１４９９である請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１４】
前記酵母が、Pichia anomalaに属する微生物である請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１５】
前記酵母が、Pichia anomala Ｆｅｒｍ Ｐ−２０５０４である請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１６】
前記酵母が、Pichia anomala ＪＣＭ３５８５である請求項１０に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１７】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させ、生成されたオリゴ糖を採取することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項１８】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項１９】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスにβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項２０】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製酵素を作用させることにより、請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項２１】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、該抽出エキス中に請求項１乃至４の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項２２】
請求項１８乃至２１の何れか１項から選ばれた製造方法により得られた食品。
【請求項２３】
請求項１又は２に記載のオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とするビフィズス菌増殖用組成物。
【請求項２４】
請求項１又は２に記載のオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする非う蝕性食品組成物。
【請求項２５】
請求項１、２、３及び４に記載のオリゴ糖から選ばれた１種以上のオリゴ糖を添加してなる飲食品。
【請求項２６】
請求項１、２、３及び４に記載のオリゴ糖から選ばれた１種以上のオリゴ糖を添加してなる飼料。
【請求項２７】
請求項１又は２に記載のオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする非う蝕性口腔用組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加した食品、新規オリゴ糖の製造方法及びその機能性に関し、詳しくはグルコースの６位にフルクトースがピラノース型でβ結合した新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加してなる食品、グルコースとフルクトースあるいはラミナリビオースとフルクトースの高濃度液にβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることによって得られる新規オリゴ糖の製造方法、及び該オリゴ糖を含有する非う蝕性食品組成物、ビフィズス菌増殖組成物に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
さらに本発明は、人体に難消化性で、ビフィズス菌にのみ特異的に消化されるビフィズス菌増殖用組成物を提供することを目的とする。さら本発明は、虫歯形成の予防に有用な非う蝕性食品組成物を提供することを目的とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【化１】
（式中、Ｒ1 は、水素原子、又は位置番号３で結合するグルコース、Ｒ2 は、水素原子、又は位置番号１で結合するグルコースを表し、Ｒ1 とＲ2 は同時にグルコースではない。）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明で使用することができる酵母としては、Saccharomyces 属に属する微生物、Pichia属に属する微生物、Candida 属に属する微生物、Hansenula 属に属する微生物が挙げられる。さらに具体的な酵母の種としては、Saccharomyces cerevisiae、Pichia anomalaが挙げられる。さらに具体的な酵母の菌株としては、Pichia anomala（Ｆｅｒｍ Ｐ−２０５０４）、Pichia anomala ＪＣＭ３５８５が挙げられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明の式（１）又は式（２）で表されるオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖用組成物の有効成分、或いは非う蝕性食品組成物の有効成分である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
さらに、本発明の式（１）、式（２）で表されるオリゴ糖は、肥満症や糖尿病など種々の疾患の改善作用、ビフィズス菌増殖作用、非う蝕作用を付与する機能性食品として食品素材、医薬品素材、口腔用組成物への利用が可能である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
本発明の糖１のう蝕性
宮村（歯学、６０、７１７〜７３１、１９７３）の方法に準じ、水１ｍＬ、又は、各１．２５％の本発明の糖１、グルコース又はパラチノース各１ｍＬに、それぞれハートインフージョンブイヨン１ｍＬと新鮮唾液３ｍＬを添加してなる４種類の溶液について、３７℃におけるｐＨの経時変化を調べた。また、該方法において、新鮮唾液の代わりに、
Streptococcus mutans JCM5705を接種したものについても同様にpHの経時変化を調べた。この結果を新鮮唾液に関しては図２２、Streptococcus mutans JCM5705を接種したものについて図２３に横軸に時間縦軸にｐＨをとったグラフにして示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
本発明のオリゴ糖は難消化性の甘味料として有用である。さらに、本発明のオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖作用、非う蝕作用を付与する機能性食品として食品素材、或いは医薬品素材、口腔用組成物として有用である。
- 【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加した食品、新規オリゴ糖の製造方法及びその機能性に関し、詳しくはグルコースの６位にフルクトースがピラノース型でβ結合した新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加してなる食品、グルコースとフルクトースあるいはラミナリビオースとフルクトースの高濃度液にβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることによって得られる新規オリゴ糖の製造方法、及び該オリゴ糖を含有する非う蝕性組成物、ビフィズス菌増殖組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
末端のフルクトース残基がピラノース構造のオリゴ糖はいくつか報告されているが、グルコースと結合したフルクトース残基がピラノース構造をとるものは少なく、ツラノース、ロイクロースが知られている程度である。又、末端のフルクトース残基がピラノース構造のオリゴ糖の機能性についての報告も知られていない。またβ−フルクトフラノシダーゼを、高糖濃度のグルコースとフルクトースの条件下で作用させると、グルコースの６位にピラノース型でフルクトースを結合させる反応は報告されていない。
【０００３】
ところで、ネオケストースを部分加水分解することにより、グルコースとフルクトースが２−６結合したオリゴ糖として、β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−α−Ｄ−グルコピラノースが得られることは非特許文献１により知られているが、該オリゴ糖はフルクトース部分がフラノース型となっており、ピラノース型ではない。
【０００４】
ビフィズス菌の効用として、腸内腐敗菌による腐敗の抑制作用、発ガン抑制作用、毒性アミンの産生防止作用、病原菌による感染症に対する抑止作用等が広く知られている。腸内でビフィズス菌を増殖させるためには、摂取されてから途中で消化されずに回腸や大腸に到達すること、ビフィズス菌以外の菌に利用されないことおよびビフィズス菌が良く利用することの諸条件を満たすことが必要であることが知られている。
【０００５】
近年、いわゆる虫歯と呼ばれるう蝕の原因が、口腔内でう蝕原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans, St. mutans）やストレプトコッカス・ソブリナス（St. sobrinus）によって産生されるグルコース転移酵素（glucosyltransferase, GTase）の作用によって、蔗糖から不溶性でかつ付着性のあるグルカンが生成され、この不溶性付着性グルカンが歯牙に結合した後、さらにミュータンス菌などの細菌をグルカンの中に引き込んで歯垢を形成し、この歯垢内の細菌が酸を生成することにあることが明らかにされている。甘味、物理的性状の点で優れており、甘味料として広く飲食物に使用されている蔗糖は、歯質を脱灰する酸の基質となるだけでなく、歯垢中に酸を停滞させ、脱灰を持続させる働きを有する不溶性付着性グルカンの基質ともなるものであり、ミュータンス菌のう蝕原因性因子の多くが、蔗糖の存在によって発現されることが証明されている。
【非特許文献１】Journal of Chromatography A, 920(2001)299-308
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な構造を持つオリゴ糖を提供することを課題とする。また本発明は、ピラノース型でフルクトース転移活性を有する酵素の反応を利用して新規オリゴ糖の製造方法を確立することを目的とする。
【０００７】
さらに本発明は、人体に難消化性で、ビフィズス菌にのみ特異的に消化されるビフィズス菌増殖用組成物を提供することを目的とする。さら本発明は、虫歯形成の予防に有用な非う蝕性組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、植物エキス発酵液中の新規オリゴ糖について検索し、分離し、ＴＯＦ−ＭＳ分析、メチル化糖のＧＣ−ＭＳ分析およびＮＭＲ分析した結果、いかなる標品とも一致しない未知のオリゴ糖を検出した。このオリゴ糖は植物エキス発酵液の発酵前ではほとんど見られず、発酵熟成後に検出される。
【０００９】
このオリゴ糖はピラノース型フルクトースがグルコースに２−６結合したオリゴ糖を基本骨格とする。
【００１０】
ところで、前記背景技術で示したように、ネオケストースを部分加水分解することにより得られるオリゴ糖は、β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−α−Ｄ−グルコピラノースである（非特許文献１）が、該オリゴ糖はフルクトース部分がフラノース型となっており、本発明のオリゴ糖の基本骨格におけるフルクトース部分がピラノース型であるものとは、異なる。
【００１１】
即ち、本発明の新規オリゴ糖は、下記一般式（１）で表される化合物である。
【００１２】
【化１】
（式中、Ｒ1 は、水素原子、又は位置番号３で結合するグルコース、Ｒ2 は、水素原子、又は位置番号１で結合するグルコースを表す。）
【００１３】
前記一般式（１）に属する具体的な本発明のオリゴ糖は、下記式（２）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｄ−グルコピラノースである。
【００１４】
【化２】
【００１５】
前記一般式（１）に属する本発明の別の具体的なオリゴ糖は、下記式（３）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ο−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）−Ｄ−グルコピラノースである。下記式（３）のオリゴ糖は、ラミナリビオースの非還元末端のグルコース残基の６位にフルクトースがピラノース型で結合した化合物に相当する。
【００１６】
【化３】
【００１７】
前記一般式（１）に属する本発明のさらに別の具体的なオリゴ糖は、下記式（４）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ο−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］−Ｄ−グルコピラノースである。下記式（４）の化合物は、ラミナリビオースの還元末端のグルコース残基の６位にフルクトースがピラノース型で結合した化合物に相当する。
【００１８】
【化４】
【００１９】
本発明のオリゴ糖の製造方法は、植物を切断したものに原料重量の１／１０量以上２倍量以下、好ましくは、１／５量以上２倍量以下、最も好ましくは、１／４量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に前記式（１）〜式（４）で表される本発明の何れかのオリゴ糖を生成させ、得られた植物発酵エキス中からオリゴ糖を採取することを特徴とする。
【００２０】
植物発酵エキスは、以下の様に製造される。植物原料としては、リンゴ、ニンジン、大根、キャベツ、セロリ、キュウリ、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草、ナシ、ミカンの皮、トマト、ピーマン、ブラックマッペモヤシ、ナス、レンコン、カボチャ、シイタケ、ショウガ、レタス、ニンニク、三つ葉、ウド、アスパラガス、熊笹、クローバー、昆布、フキノトウ、タンポポ、オオバコ、エンドウモヤシ、スギ葉、パセリ、カブ、パイナップル、ブドウ、イチゴ、イタドリの若芽、アサツキ、白菜、エノキタケ、サラダ菜、シュンギク、ヨモギ、セリ、ニラ、トドマツ葉、青シソ、ワカメ等が挙げられ、これらの植物原料のうち２種以上、好ましくは、多種類が用いられる。
【００２１】
上記植物原料の配合割合として、例えばリンゴでは植物原料総重量の０．１から５０％、ニンジンでは０．１から５０％、大根では０．０５から４０％、キャベツでは０．０５から４０％、セロリやキュウリでは０．０１から３０％、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草では０．０１から３０％とすることが望ましいが、特に制限されるものではない。
【００２２】
これらの植物原料を１〜５ｃｍ幅、好ましくは１〜４ｃｍ幅、最も好ましくは２〜３ｃｍ幅に切断し、全ての原料を杉樽中に入れ、これに、ショ糖を混合し、圧搾せずに浸透圧を利用して、３日間から３週間抽出する。ショ糖の混合割合については、全体として１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにし、好ましくは、植物原料とほぼ等量のショ糖を添加して混合することが望ましい。同時に、数ｐｐｍ程度の濃度となるように若干量の食塩を添加混合してもよい。
【００２３】
圧搾せずに回収した抽出エキスを３７℃で暗所で保存すると主として酵母（例えば、Saccharomyces 属に属する微生物）および乳酸球菌（例えば、Leuconostoc 属に属する微生物）により自然発酵する。発酵後、さらに３７℃で約半年間以上熟成させると褐色、粘稠性液体の植物発酵エキスが得られる。得られた植物発酵エキスから以下のようにして、本発明のオリゴ糖を採取することができる。或いは、得られた植物発酵エキスを食品とすることができる。
【００２４】
植物発酵エキスをカラムクロマトグラフィーに通し、溶出することにより本発明のオリゴ糖を採取することができる。得られたオリゴ糖をさらにＨＰＬＣにかけることにより分離、精製し、凍結乾燥することにより、精製された粉末状の本発明のオリゴ糖を得ることができる。
【００２５】
植物発酵エキスを製造しない、効率的な本発明のオリゴ糖の製造方法は、１０質量％以上８０質量％以下、好ましくは、２０質量％以上８０質量％以下、最も好ましくは、２５質量％以上８０質量％以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより前記式（１）〜式（４）で表される新規オリゴ糖を生成させ、該溶液中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。
【００２６】
本発明のオリゴ糖の製造方法で使用するβ−フルクトフラノシダーゼについては、市販のβ−フルクトフラノシダーゼを使用することができ、或いは、β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する酵母、乳酸菌等から抽出し、精製した酵素が用いられる。市販のβ−フルクトフラノシダーゼには、例えば、β−フルクトフラノシダーゼ（シグマ社製、Ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｋｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ Ｇｒａｄｅ VII:商品名）を用いることができる。β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物については、酵母及び乳酸菌から選ばれた１種以上を用いることができる。
【００２７】
本発明で使用することができる酵母としては、Saccharomyces 属に属する微生物、Pichia属に属する微生物、Candida 属に属する微生物、Hansenulau属に属する微生物が挙げられる。さらに具体的な酵母の種としては、Saccharomyces cerevisiae、Pichia anomalaが挙げられる。さらに具体的な酵母の菌株としては、Pichia anomala（Ｆｅｒｍ ＡＰ−２０５０４）、Pichia anomala ＪＣＭ３５８５が挙げられる。
【００２８】
本発明で使用することができる乳酸菌としては、Leuconostoc 属に属する微生物、Bifidobacterium 属に属する微生物、Lactobacillus 属に属する微生物、Streptococcus 属に属する微生物、Pediocuccus 属に属する微生物、Lactocossus 属に属する微生物が挙げられる。さらに具体的な乳酸菌の種としては、Leuconostoc mesenteroides が挙げられる。ができる。
【００２９】
また、本発明のオリゴ糖の製造方法は、前記精製した酵素を用いたオリゴ糖の製造方法において、精製した酵素に代えて、前記β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物からβ−フルクトフラノシダーゼを抽出し、粗精製した酵素を用いて、同様にオリゴ糖を製造することができる。即ち、本発明のオリゴ糖の製造方法は、１０質量％以上８０質量％以下、好ましくは、２０質量％以上８０質量％以下、最も好ましくは、２５質量％以上８０質量％以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られたβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有する粗精製酵素を作用させることにより前記式（１）〜式（４）で表される新規オリゴ糖を生成させ、該溶液中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。
【００３０】
またさらに別の効率的な本発明のオリゴ糖の製造方法は、精製したβ−フルクトフラノシダーゼ或いは粗精製のβ−フルクトフラノシダーゼを用いずに、直接、β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物を用いる方法であり、即ち、１０質量％以上８０質量％以下、好ましくは、２０質量％以上８０質量％以下、最も好ましくは、２５質量％以上８０質量％以下の糖質を含む培地溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させて発酵させ、培地中に前記式（１）〜式（４）で表される新規オリゴ糖を生成させ、該培地中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。
【００３１】
粗精製酵素を製造する方法には、例えば、培養液を遠心分離して菌体を集め超音波で破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して菌体を集め乳鉢で破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して菌体を集めてビーズビーダーで破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して、その上澄みを透析した内液を回収する方法が挙げられる。
【００３２】
精製した酵素を製造する方法には、粗精製酵素を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを１種類以上を組み合わせて精製する方法があげられる。
【００３３】
該微生物を用いる方法において使用するβ−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物は、前記に列挙したβ−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物を用いることができる。
【００３４】
前記培養による本発明のオリゴ糖の製造方法において用いる糖質としてはショ糖が好ましい。前記のオリゴ糖の製造方法において、微生物の培溶液、或いは酵素の基質溶液等の出発原料の糖濃度は、通常の発酵プロセスにおいて培養液中に含まれる糖濃度に比べて、本発明の場合は極めて高濃度であり、本発明において特有な範囲である。基質溶液或いは培養液の糖濃度が１０質量％未満ではオリゴ糖の合成量が少なく効率的ではなく、７０質量％を超えると酵母の増殖が困難となる。これは、高糖濃度による高浸透圧となるからと考えられる。
【００３５】
図１は、糖質としてグルコースとフルクトースの質量比を１：１とし、種々の糖濃度の溶液を調製し、該溶液１ｍＬに対してβ−フルクトフラノシダーゼ２０ユニットを添加し、３７℃で１６８時間反応させたときの各種糖濃度（横軸）に対するオリゴ糖の相対合成量（縦軸）を表すグラフである。図１における相対合成量については、糖濃度が８０％のとき、オリゴ糖の合成量が最大となったので、これを相対合成量１００％と定義した。
【００３６】
図１のグラフによれば、糖濃度が低ければ、本発明のオリゴ糖の合成量は少ないが、糖濃度が高ければ、合成されるオリゴ糖も、糖濃度が８０％迄は比例して多くなり、８０％が最大の合成量となるが、９０質量％となるとオリゴ糖の合成量が低下することがわかる。
【００３７】
本発明の式（１）又は式（２）で表されるオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖用組成物の有効成分、或いは非う蝕性組成物の有効成分である。
【００３８】
本発明のオリゴ糖の製造方法で使用する糖質については、植物を切断したものを原料とする場合には、植物中に含まれる糖と、添加するショ糖が用いられる。また、基質溶液又は培地を原料とする場合には、これらに添加する糖には、グルコースとフルクトースの組み合わせ、或いはラミナリビオースとフルクトースの組み合わせが用いられる。
【００３９】
本発明の培養によるオリゴ糖の製造方法で使用する、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物については、前記した微生物を用いることができる。
【００４０】
本発明は前記新規なオリゴ糖を添加した食品又は飼料としても有用である。食品又は飼料に添加される本発明のオリゴ糖の添加量は、食品又は飼料に含まれる消化性糖の全質量の０．０５以上３０質量％以下となるように添加することが、食品又は飼料中に含まれる消化性糖の過剰摂取を防止する目的のために好ましい。
【００４１】
本発明の食品の製造方法の別の方法は、植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスにβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。
【００４２】
本発明の食品の製造方法のさらに別の方法は、植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して、抽出することにより抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製酵素を作用させることにより、前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。
【００４３】
本発明の食品の製造方法のさらに別の製造方法は、植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、抽出エキス中に前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。
【００４４】
本発明のオリゴ糖は、酵素反応液又は培養液を濾過、精製して液状で使用することも、また、濃縮してシラップ状で利用することも、更に、乾燥し固体状で用いることもできる。さらに、精製工程を経て、夾雑糖類を除去して本発明のオリゴ糖の高含有画分を採取したもの、或いはさらに精製し、粉末化或いは結晶化したものを用いることができる。粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型して使用することもできる。
【００４５】
式（１）で表されるオリゴ糖は、ショ糖の甘味度の約１／５程度であり、乳糖やβ−ガラクトースに近い甘味であり、概ねさっぱりとした甘味である。
【発明の効果】
【００４６】
本発明のオリゴ糖は、新規化合物として有用である。本発明の式（１）、式（２）で表されるオリゴ糖は、難消化性であるので、高血糖症状及び高血糖に起因する肥満症や糖尿病など種々の疾患の改善に有用である。
【００４７】
本発明の式（１）、式（２）で表されるオリゴ糖はビフィズス菌増殖作用を有するので、該オリゴ糖を添加した食品は、腸内腐敗菌による腐敗の抑制、発ガン抑制、毒性アミンの産生防止、病原菌による感染症に対する抑止等に用いることができる。
【００４８】
本発明の式（１）、式（２）で表されるオリゴ糖はう蝕誘発菌などによって発酵されにくく、う蝕誘発菌による蔗糖からの不溶性グルカン合成を阻害するので、虫歯を起こしにくいオリゴ糖として、う蝕抑制剤（非抗蝕剤）などに有利に利用できる。
【００４９】
また、本発明の式（１）、式（２）で表されるオリゴ糖は甘味料として利用可能である。
【００５０】
さらに、本発明の式（１）、式（２）で表されるのオリゴ糖は、肥満症や糖尿病など種々の疾患の改善作用、ビフィズス菌増殖作用、非う蝕作用を付与する能性食品として食品素材、医薬品素材、口腔用組成物への利用が可能である。
【実施例１】
【００５１】
植物発酵エキスの調製
植物抽出エキスの原料として以下の配合の材料を２〜３ｃｍ幅に切断したものを使用した。
【００５２】
リンゴ 植物原料総重量の２０％
ニンジン 同 １６％
大根 同 １２％
キャベツ 同 １０％
セロリ 同 ９％
キュウリ 同 ９％
バナナ 同 ６％
玉ねぎ 同 ６％
ゴボウ 同 ６％
ホウレン草 同 ６％
【００５３】
これらの植物原料全重量に対して、当量のショ糖を加えて一週間抽出し、抽出液を上記微生物により自然発酵させた後、３７℃で約半年間熟成させることにより、褐色の粘稠性の液状の植物発酵エキスを得た。
【００５４】
オリゴ糖の測定
植物エキス発酵液の発酵前及び発酵後の液１０μＬにＡＢＥＥ標識試薬（Ｊ−オイルミルズ社製）４０μＬ加え、８０℃１時間反応させた。２００μＬ蒸留水及び２００μＬクロロホルムを加えよく撹拌した後、遠心分離しその上清を適当に希釈した。標識化された糖をＨｏｎｅｎｐａｋ Ｃ１８カラム（Ｊ−オイルミルズ）を用いたＨＰＬＣ（カラムサイズ：４．６ｍｍ×７．５ｃｍ、溶出：０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、カラム温度：室温、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ３０５ｎｍ）により分析した。その結果をＨＰＬＣのチャートとして図２に示す。図２によれば、発酵前と発酵後を比較すると、発酵後のチャートでは糖の溶出時間の経過において、フルクトースとグルコースの間にはどの標品とも一致しない、未知の糖が増加していることが確認できた。
【００５５】
未知の糖成分の分画、精製
発酵後の植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィー（４．５ｃｍ×３５ｃｍ）に添加し、エタノールのステップワイズグラジエントで溶出した。未知の糖１は、５％エタノールで溶出され、未知の糖２及び未知の糖３は１５％エタノールで順次溶出された。さらにＡｍｉｄｅ−８０（東ソー：カラムサイズ：４．６ｍｍ×２５ｃｍ、溶出：８０％アセトニトリル、カラム温度：８０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）およびＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（東ソー：カラムサイズ：４．６ｍｍ×２５ｃｍ、溶出：蒸留水、カラム温度: 室温、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）を用いたＨＰＬＣによりさらに、糖１、糖２、糖３を各々分離、精製し、各々の凍結乾燥粉末を得た。
【００５６】
化学構造の決定
前記工程において分離、精製した糖１、糖２、糖３の各々について、機器分析を行い、その化学構造を以下のように決定した。これらの糖をＰｏｓｉｔｉｖｅイオンモードで質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）した結果、糖１は３６５の〔Ｍ＋Ｎａ〕+ のイオンピークを与えた（図３）。糖２及び糖３は５２７の〔Ｍ＋Ｎａ〕+ のイオンピークを与えた（図４）。糖１を酸加水分解後、ＨＰＡＥＣ分析し、構成糖を調査したところ、グルコースとフルクトースのみから構成され、モル比は１：１であった。従って糖１はグルコース１分子とフルクトース１分子からなる２糖類であると決定した。糖２及び糖３を同様に調査した結果、グルコースとフルクトースのみから構成され、モル比は２：１であった。従って糖２及び糖３はグルコース２分子とフルクトース１分子からなる３糖類であると決定した。
【００５７】
糖１はβ−フルクトフラノシダーゼ、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼいずれによっても分解されなかった。糖１をＨａｋｏｍｏｒｉの方法でメチル化しメタノール分解した試料をＧＣ−ＭＳ分析した結果、ｍｅｔｈｙｌ ２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−
ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ｍｅｔｈｙｌ １，３，４，５−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｉｄｅが検出され（図５）、ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメントパターンは、いずれもピラノース型のシグナルと一致した。
【００５８】
糖１のＮＭＲ解析は、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＨＭＢＣ、ｃｔ−ＨＭＢＣ、Ｊ−ｒｅｓ ＨＭＢＣの２次元ＮＭＲで行った（図６−図１１）。糖２は、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＣＨ2 −ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ｃｔ−ＨＭＢＣの２次元ＮＭＲで行った（図１２−図１６）。糖３は、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＨＭＢＣ、ｃｔ−ＨＭＢＣの２次元ＮＭＲで行った（図１７−図２１）。
【００５９】
また糖１のケミカルシフトを表１に、糖２及び糖３のケミカルシフトを表２及び表３に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】
【００６３】
以上の結果から糖１は、前記式（２）に示すβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）Ｄ−グルコピラノース、糖２は、前記式（３）に示すβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）Ｄ−グルコピラノース、糖３は、前記式（４）に示すβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］Ｄ−グルコピラノースであると決定した。
【実施例２】
【００６４】
製造方法１−１：市販酵素を用いた糖１の製造方法
２０％グルコース（シグマ社製）及び２０％フルクトース（シグマ社製）を含む水溶液１００ｍＬに、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、１０ｍＬ）に溶解したβ−フルクトフラノシダーゼ（シグマ社製、Ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｋｅｒ’ｓ
ｙｅａｓｔ Ｇｒａｄｅ VII ：商品名）２０００ユニットを添加した。さらに少量のトルエンを防腐のため加えた。３７℃で２４時間以上加温し反応生成物を得た。反応生成物を前記実施例１と同様にして精製して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥品を前記実施例１と同様にしてＴＯＦ−ＭＳおよびＮＭＲ解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式（２）で表される糖１のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）Ｄ−グルコピラノースであった。
【実施例３】
【００６５】
製造方法１−２：市販酵素を用いた糖２及び糖３の製造方法
２０％ラミナリビオース（シグマ社製）及び２０％フルクトース（シグマ社製）を含む水溶液１００ｍＬに０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、１０ｍＬ）に溶解したβ−フルクトフラノシダーゼ（シグマ社製、ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｋｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ Ｇｒａｄｅ VII：商品名）２０００ユニットを添加した。さらに少量のトルエンを防腐のため加えた。３７℃で２４時間以上加温し反応生成物を得た。反応生成物を前記実施例１と同様にして精製して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥品を前記実施例１と同様にしてＴＯＦ−ＭＳおよびＮＭＲ解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式（３）で表される糖２のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）Ｄ−グルコピラノース、及び前記式（４）で表される糖３のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］Ｄ−グルコピラノースであった。
【実施例４】
【００６６】
製造方法２−１：市販菌を用いた発酵による製造方法
グルコース４０ｇ、ポリぺプトン（日本製薬製）４ｇ、酵母エキス（オリエンタル酵母) ２ｇに蒸留水を加えて１００ｍＬとし、オートクレーブで滅菌後、除菌濾過した４０％フルクトース溶液１００ｍＬと混合し培養液とした。これにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＪＣＭ １４９９（独立行政法人 理化学研究所により頒布）を一白金耳添加して３０℃で４８時間以上培養し、培養液を得た。培養液を前記実施例１と同様に分離精製して反応生成物を得た。前実施例１と同様にしてＴＯＦ−ＭＳおよびＮＭＲ解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式（２）で表される糖１のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）Ｄ−グルコピラノース、前記式（３）で表される糖２のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）Ｄ−グルコピラノース、及び前記式（４）で表される糖３のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］Ｄ−グルコピラノースであった。
【実施例５】
【００６７】
製造方法２−２：分離菌株を用いた発酵による製造方法
前記実施例４において、微生物として菌株Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ Ｆｅｒｍ
Ｐ−２０５０４（２００５年４月１３日に独立行政法人 産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託）を用いた以外は前記実施例４と同じようにして培養し、培養液から本発明の糖１、糖２、糖３を得た。該菌株は、伊達市北稀府町１２１番地の大高酵素株式会社 伊達工場内の発酵タンク内の発酵液から採取し、分離したものである。
【実施例６】
【００６８】
製造方法３−１：粗精製酵素液を用いた製造方法
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＪＣＭ １４９９をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）で７２時間培養した液を９，０００×ｇで遠心分離した。得られた沈殿に０．９％食塩水を加えて撹拌し遠心分離し、この操作を２回繰り返した。沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し超音波破砕した後、遠心分離し上清を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対し透析した。得られた液を粗精製酵素液とした。
【００６９】
２０％グルコース（シグマ社製）及び２０％フルクトース（シグマ社製）を含む水溶液１００ｍＬに前記工程で得られた粗精製酵素液１０ｍＬと加え、３７℃で２４時間以上加温し反応生成物を得た。前記実施例１と同様にして得られた反応生成物を精製して本発明の糖１を得た。
【実施例７】
【００７０】
本発明の糖１を添加したバターロールの製造例
以下の材料を用いて常法によりバターロールを製造した。
【００７１】
強力粉 ５００ｇ
食塩 ５ｇ
牛乳 １５０ｍＬ
卵黄 １０ｇ
前記式（２）で表されるオリゴ糖（糖１） ２０ｇ
生イースト １２．５ｇ
【実施例８】
【００７２】
本発明の糖１を添加したハードキャンディーの製造例
ショ糖１１０ｇに蒸留水４３．５ｇを加え、３０分間で１７７℃まで加熱した。その後１００℃に保ち、前記式（２）で表されるオリゴ糖（糖１）の２．５ｇを３回に分け加え、よく撹拌した。その後あらかじめ用意した型に流し込み放冷することにより、ハードキャンディーを得た。
【実施例９】
【００７３】
本発明の糖１を添加した産卵鶏用飼料の製造例
トウモロコシ１００ｇ、大麦１２０ｇ、小麦１００ｇ、コウリャン１１０ｇ、米糠１１０ｇ、ふすま２００ｇ、大麦ふすま１００ｇ、大豆かす３０ｇ、魚粉７０ｇ、炭酸カルシウム５４．５ｇ、食塩５ｇ、粉末肝油０．５ｇに前記式（２）で表されるオリゴ糖（糖１）を２％となるように添加し混合することにより産卵鶏用飼料を得た。
【実施例１０】
【００７４】
本発明の糖１の消化性
人工胃液、ラット小腸アセトン粉末、酵母由来α−グルコシダーゼによる本発明の糖１の分解性について下記のように試験した。
【００７５】
人工胃液による分解性は、２％本発明の糖１の５０μＬと５０ｍＭ ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ２．０）２５μＬを加えて、３７℃で１００分間反応後、１０ｍＭ ＮａＯＨを３０μＬ添加し中和した。混合後、直ちに中和したものを対照とした。この反応液をＨＰＬＣ分析し、分解物を調べた。
【００７６】
ラット小腸アセトン粉末の調製は、ラット小腸アセトン粉末（ｓｉｇｍａ社製）３００ｍｇに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．７ｍＬを加えてガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、１０，０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心分離し、得られた上澄みを酵素液とした。マルターゼ活性として１ｍＬあたり４ユニットとなるように希釈した酵素液２５μＬ、４％の本発明の糖１を２５μＬ、水５０μＬを加えて、３７℃１０分間反応させ１００℃で５分間加熱し、反応を停止した。
【００７７】
酵母由来のα−グルコシダーゼも同様に、１ｍＬあたり４ユニットとなるように調製したα―グルコシダーゼ２５μＬ、水５０μＬを加えて、３７℃１０分間反応させ１００℃で５分間加熱し、反応を停止した。
【００７８】
これらの試験の結果、全ての反応において本発明の糖１は殆ど分解されなかった。したがって、本発明の糖１は、難消化性糖質であることがわかる。
【実施例１１】
【００７９】
本発明の糖１のう蝕性
宮村（歯学、６０、７１７〜７３１、１９７３）の方法に準じ、水１ｍＬ、又は、各１．２５％の本発明の糖１、グルコース又はパラチノース各１ｍＬに、それぞれハートインフージョンブイヨン１ｍＬと新鮮唾液３ｍＬを添加してなる４種類の溶液について、３７℃におけるｐＨの経時変化を調べた。また、該方法において、新鮮唾液の代わりに、
Streptococcus mutans JCM5705を接種したものについても同様にpHの経時変化を調べた。この結果を新鮮唾液に関しては図２２、Streptococcusmutans JCM5705を接種したものについて図２３に横軸に時間縦軸にｐＨをとったグラフにして示す。
【００８０】
これらのグラフによれば、グルコースでは培養１０時間前後から酸の産生によるｐＨの低下が認められたのに対して、本発明の糖１ではｐＨの低下が殆どなく、その低下は非う蝕性糖質であるパラチノースとほぼ同等であった。
【実施例１２】
【００８１】
本発明の糖１のヒト由由来腸内細菌の代表株による資化性
ヒト由来腸内細菌の代表株を用い、本発明の糖１の資化性について次のようにして試験を行った。なお、比較のため、グルコース、スクロース、ラクトース、メリビオース、パラチノース、ツラノース、ラフィノース、１−ケストースも同様に試験を行った。供試菌株は、Bifidobacterium 属に属する微生物５株（B.adolescentis、B.bifidum、B.breve、
B.infantis、B.longum）、Lactobacillus属に属する微生物３株（L.acidophilus、
L.casei、L.fermentum)、その他の微生物株４株（Enterobacter cloacae、Echerichia
coli、Enterococcus faecalis、Clostridium perfringens)を用いた。
【００８２】
各菌株の前培養には、炭素源を０．５％グルコースとしたＬＢ培地を用いた。次にＬＢ培地を用いて資化性試験を行った（「腸内菌の世界」、光岡知足著、叢文社発行の方法に準じた。）
【００８３】
ＬＢ培地の組成は、Proteose peptone No.3（１０ｇ）、Trypticase（５ｇ）、Yeast extract（３ｇ）、Tween 80（１ｇ）、Solution B（５ｍＬ）、L-cysteine HCl・H2 O（０．２ｇ）、寒天（１．５ｇ）をBacto-Liver浸出液１Ｌに溶解し、ｐＨ７．２に調製後、滅菌処理した。
【００８４】
前記Solution Bとは、４．０％MgSO4・7H2O、０．２％FeSO4・7H2O、０．２％NaCl、０．１３５％Mn SO4 となるように精製水に溶解したものである。
【００８５】
前記Bacto-Liver浸出液とは、Bacto-Liver５．５ｇに１０５０ｍＬの精製水を加え、５０〜６０℃の温浴中で時々撹拌しながら１時間浸出した後、濾紙でろ過したものである。
【００８６】
本実施例で用いたＬＢ培地は、滅菌処理後、最終濃度が０．５％になるように前記各糖を加えた。前記各糖は、メンブランフィルターでろ過して滅菌処理を行った。一方、前培養した各菌株は、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）し、得られた沈殿に、０．８％生理食塩水を２ｍＬ加え、よく撹拌して洗菌し、同様の条件で遠心分離した。この作業を２度繰返し、最終段階で、各菌株濃度が同じになるように生理食塩水を加え、ＬＢ培地に接種した。接種したＬＢ培地は、嫌気ジャーを用い、窒素ガス下で嫌気的に３７℃で、７２時間培養した。
【００８７】
発酵試験培地に前記各種菌株を接種し、７２時間の培養後、３０℃のウォーターバス内で加温しながら培地のｐＨを測定した。資化性の有無、または強弱はｐＨの低下で判定した。糖を加えていない培地に菌株を接種したもののｐＨを対照として、判定基準は、ｐＨが４．５未満のものを（＋＋＋）、ｐＨが４．５以上５．０未満のものを（＋＋）、ｐＨが５．０以上５．５未満のものを（＋）、ｐＨが５．５以上６．０未満のものを（±）、ｐＨが６．０以上のものを（−）とした。
資化性の結果を下記の表４に示す。
【００８８】
【表４】
【００８９】
表４によれば、本発明の糖１はBifidobacterium属に属する数種の菌種によってのみ利用され、他の属に属する菌種では資化されにくい糖質であることがわかる。したがって、本発明の糖１は、ビフィズス菌増殖用の糖質として利用できることがわかる。
【実施例１３】
【００９０】
甘味度及び甘味の質
本発明の糖１の５％溶液と、０．５％〜３．０％のショ糖溶液を調製し、５人の被験者による官能試験により甘味度と甘味の質を判定した。その結果、ショ糖の甘味度を１００とした場合、本発明の糖１の甘味度は約２０であった。この甘味度は乳糖及びβ−ガラクトースに近いものであり、概ね、さっぱりとした甘味であった。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のオリゴ糖は難消化性の甘味料として有用である。さらに、本発明のオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖作用、非う蝕作用を付与する能性食品として食品素材、或いは医薬品素材、口腔用組成物として有用である。
- 【公開番号】特開２００７−１９７３（Ｐ２００７−１９７３Ａ）
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【発明の名称】新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加した食品、その製造方法、非う蝕性食品組成物、及びビフィズス菌増殖組成物
【発明者】
【氏名】岡田 秀紀
【氏名】山森 昭
【氏名】川添 直樹
【氏名】塩見 徳夫
【氏名】小野寺 秀一
【氏名】川端 潤
【氏名】福士 江里
【氏名】菊地 政則
- 【出願番号】特願２００６−１４１６８８（Ｐ２００６−１４１６８８）
【出願日】平成１８年５月２２日（２００６．５．２２）
【出願人】
【識別番号】３０３０２７３３５
【氏名又は名称】大高酵素株式会社
- 【代理人】
【識別番号】１０００９９１３９
【弁理士】
【氏名又は名称】光来出 良彦
★当サイトのどのページも全てリンクフリーです、自由にお使いください
※以下のタグをホームページ中に張り付けると便利です。
★携帯電話でも特許データを見られます 携帯URL：http://m.tokkyoj.com/md/tk2007-1973.php
【友達に教える】
スポンサード リンク
English