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表面弾性波デバイスバイオセンサ
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- 【要約】
【課題】 圧電型基板上に発生させる表面弾性波（ＳＡＷ）を利用する事により、従来では、光学顕微鏡のみの観察であった細胞の増殖・成長・傷害修復過程を、ＳＡＷ伝搬経路上に形成された細胞の物理的、化学的変化によるＳＡＷ伝搬特性として計測することによって検出可能な表面弾性波デバイスバイオセンサを提供する。
【解決手段】 圧電型基板２２に接合させたＩＤＴ２３に高周波電流又は電圧を印加し、圧電型基板２２の表面近傍にＳＡＷ２５を発生させ、このＳＡＷ２５の伝搬特性によって細胞の物理的、化学的変化を検出するＳＡＷデバイスセンサ２１において、前記ＩＤＴ２３にSiO2を成膜し、圧電型基板２２上に擬似マトリックス２７をコーティング処理した後、培養細胞２８からなるＳＡＷ伝搬経路２４を形成して２チャンネル化し、一方の１チャンネルで温度と溶液質量による変化を補正し、他方の１チャンネルで細胞の物理的、化学的変化を検出するようにした。
- 【特許請求の範囲】
【請求項１】
圧電型基板に接合させた櫛型電極からなる素子に高周波電流又は電圧を印加し、その圧電材表面近傍に表面弾性波を発生させ、その表面弾性波の伝搬経路に細胞を播種・培養することで形成した人工組織又は細胞に対する物理的、化学的変化を検出することを特徴とした表面弾性波デバイスバイオセンサ。
【請求項２】
前記圧電型基板に接合させた櫛型電極からなる素子からなり、伝搬する表面弾性波の成分が、完全水平せん断成分からなり、湿潤状態の生きた細胞又は人工組織からの表面弾性波の信号変化の検出感度を向上させた請求項１記載の表面弾性波デバイスバイオセンサ。
【請求項３】
前記圧電型基板に接合させた櫛型電極からなる素子を多チャンネル化して、そのうちの一つもしくは複数のチャンネルを、温度、溶液質量、溶質濃度のゆらぎ等の測定環境変化に起因する表面弾性波の信号への外乱因子の除去や補正用参照チャンネルとして使用し、人工組織又は細胞に起因する因子のみによる物理的、化学的変化の表面弾性波の検出感度を向上させた請求項１又は２記載の表面弾性波デバイスバイオセンサ。
【請求項４】
前記圧電型基板に接合させた櫛型電極からなる表面弾性波の伝搬経路上に、細胞を定着・生育させるための擬似マトリックスコーティング処理をしたのち細胞を播種・培養し接着性を高め、細胞の成長過程を検出する請求項１乃至３のいずれかに記載の表面弾性波デバイスバイオセンサ。
【請求項５】
前記圧電型基板に接合させた櫛型電極からなる表面弾性波の伝搬経路上に、擬似マトリックスコーティング処理したのち細胞を播種・培養して人工組織を形成し、機械的損傷又は剥離に対する細胞又は人工組織の傷害修復の過程を検出する請求項１乃至４のいずれかに記載の表面弾性波デバイスバイオセンサ。
【請求項６】
前記表面弾性波の伝搬経路上に、擬似マトリックスコーティング処理したのち細胞を播種・培養し、環境因子の負荷又は薬剤や化学物質の投与による細胞又は人工組織の活性度変化を検出する請求項１乃至３のいずれかに記載の表面弾性波デバイスバイオセンサ。
【請求項７】
前記表面弾性波の伝搬経路上に、擬似マトリックスコーティング処理したのち細胞を播種・培養し、音弾性効果を利用して細胞又は人工組織の形質、特に細胞−細胞間ないし細胞−基質間結合力、及び内部応力の変化を検出する請求項１乃至４のいずれかに記載の表面弾性波デバイスバイオセンサ。
【請求項８】
前記表面弾性波の伝搬経路を１つの素子内に平面状のＸ軸もしくはＸ−Ｙ軸座標軸用に多チャンネル配置させ、表面弾性波の伝搬経路上に細胞を播種・培養し、環境因子の負荷又は薬剤や化学物質の投与による細胞又は人工組織の活性度、傷害修復や形質の変化を検出し、各チャンネルの信号変化を検出する請求項１乃至７のいずれかに記載の表面弾性波デバイスバイオセンサ。
【請求項９】
前記表面弾性波の伝搬経路を１つの素子内に平面状のＸ軸もしくはＸ−Ｙ軸座標軸用に多チャンネル配置させ、細胞又は人工組織の活性度、傷害修復や形質の変化を信号変化から画像処理により可視化を行うことができる請求項１乃至８のいずれかに記載の表面弾性波デバイスバイオセンサ。
- 【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面弾性波の伝搬経路上に擬似マトリックス処理を施した後、細胞を播種・培養し、前記伝搬経路上に構築した人工組織に対して様々な要素を負荷させることにより発生する生体影響や健康影響に関連する種々の物理的・化学的変化を表面弾性波の伝搬特性の変化に着目して、高感度で測定できる無給電方式かつワイヤレスに特徴を有する表面弾性波デバイスバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、工学および医学分野において利用されている超音波は、水中あるいは固体中を伝わる弾性波動（バルク波）が主体である。これに対し、弾性体の表面付近にエネルギーを集中させて伝搬する表面弾性波（ＳＡＷ）も近年、電子・通信機器用素子として活用され、この方面の進展に重要な役割を受け持つに至っている。
【０００３】
このようなＳＡＷを利用したデバイスの機能発現の基本となっている関連技術の一つに圧電効果がある。この圧電効果は、ひずみまたは応力を加えると電荷が誘起され（順効果）、逆に電圧を加えると歪または応力が生ずる（逆効果）現象を総称して圧電効果（piezoelectric effect）といい、歴史的には電気石について順効果がキュリー兄弟（J.Curie，P.Curie，1880）により発見され、翌年リップマン（G.Lippmann）によって逆効果が見出されている。結晶が圧電効果を示すか否かは、結晶の点群対称性によって決まり、３２晶族のうち圧電効果を示すものは２０晶族である。
【０００４】
上記圧電効果を利用した電気機械変換素子は、現在の超音波応用部品の主流となっている。圧電素子には単結晶として水晶，ロッシェル塩（酒石酸カリソーダ），LiTaO3，LiNbO3など、また、多結晶体としてチタン酸バリウム（BaTiO3），ジルコチタン酸鉛（PbZrO3，PbTiO3），ニオブ酸塩などが代表的なものである。圧電振動子は、電極を有する圧電体をその全体または一部分に用いて構成された一つの弾性振動体であり、それ自体の弾性振動を圧電変換により電気的に励振、検出する機能をもっている。
【０００５】
表１に前述した圧電基本式を示す。圧電は、電気系と機械系の線形相互作用であり、エネルギー変換の一種である。その形式の分類で、物理的変数の変化を通じて行われる変換のうち、変化がゆっくりと（熱平衡に近い形で）行われる準静的変換に入る。その物理的変数は、電気系では電界Ｅと電束密度Ｄ（または分極Ｐ）、機械系（力学系）では応力ＴとひずみＳである。この相互作用を扱うにあたっては、示強（内包的）変数と示量（外包的）変数とを区別することが必要である。ここでは、ＥとＴが前者、Ｄ（またはＰ）とＳが後者である。
【０００６】
【表１】
【０００７】
表面弾性波とは、媒質の表面付近のみにエネルギーが集中して伝搬する音波であり、その波動現象は、1885年にイギリスのLord Rayleighが半無限の固体表面を伝わる波として理論的に導いた。表面弾性波には様々な種類があるがここでは、代表的なレイリー波とSH波（BGS波）について記述する。
【０００８】
レイリー波は1885年にLord Rayleighによって発見された表面弾性波である。この表面弾性波は、半無限弾性体の自由表面（十分に厚い板の表面）に沿って伝搬する。波のエネルギーは表面近くに集中しており、表面から深さ１波長以内に90％以上が含まれている。また非圧電媒質の場合、変位部分は波の進行方向と深さ方向だけを持ち、両者の成分の位相差は90°であるため、各点は楕円軌道を描く。レイリー波においては周波数に無関係にいつも一定である。このように速度が一定であることを、速度分散性がない（nondispersive）というが、これはレイリー波の大きな特徴である。また、等方体の場合と同じように、異方性媒質である圧電媒質の表面にもレイリー波が伝搬するが、一般にはすべての変位成分を持つ。ただし、速度が周波数特性を持たないのは同じである。
【０００９】
SH波（BGS波）は1969年にBleustein-Gulyaev-Shimizuによって発見された表面弾性波である。非圧電媒質では、進行方向に垂直な方向には表面弾性波（SH波）は存在しないが、圧電媒質は異方性であるために、その表面にエネルギーを集中して伝搬する純粋な横波が存在する。この波の特徴として、レイリー波同様速度分散性がなく、電気機械結合係数が大きいほど表面へのエネルギー集中度は高くなる等が挙げられる。SH波は六方晶系6mm圧電結晶や圧電セラミックスの、c軸または分極軸に平行な面を有する基板などに存在する。また粒子の変位方向が基板表面に対して平行（完全せん断型表面波）のため水分・粘性液体中でも、表面弾性波の減衰が比較的少なく、液体識別、水計測、2種混合溶液の評価、液体自動計測装置等の液中での応用等が考えられる。図１３に深さ方向に回転成分の分布を有したレイリー波の表面部での伝搬様式、図１４にSH波（Shear-Horizontal）の変位分布の状態を模式的に示す。このSH波では水平・せん断成分のみの変形モードとなり、水分湿潤物質内でも伝播可能であるので、生体液や細胞体の状態を検知できることになる。
【００１０】
圧電型基板を伝搬する表面弾性波の伝搬特性には、伝搬速度v，電気機械結合係数K2，遅延時間温度係数TCD，パワーフロー角PFAなどの値がある。表面弾性波を利用したＳＡＷデバイスの特性は、用いる圧電型基板に大きく依存する。そこで、より優れた圧電型基板に要求される特性を列挙すると次のようになる。
（１）電気機械結合係数（K2）が大きいこと。
（２）温度特性（TCD）が良いこと。
（３）スプリアス応答が小さいこと。
（４）パワーフロー角（PFA）が零であること。
（５）伝搬損失が小さいこと。
【００１１】
電気機械結合係数は、電気エネルギーから表面波エネルギーへの変換効率を示す値である。TCDは表面波の速度あるいは遅延時間の温度による変動係数を示す。スプリアス応答は、不用振動モードにより、減衰量が劣化してしまう現象のことである。パワーフロー角は櫛型電極に表面弾性波が励振されたときに、伝搬する位相速度の方向と群速度の方向の違いを表す角度である。なお、伝搬速度vが速ければ高周波用に有利であり、遅ければ遅延線用に有利である。
【００１２】
上記圧電効果及び表面弾性波を応用したデバイス（ＳＡＷデバイス）は、近年の携帯電話に代表される移動体通信市場の急速な拡大と共に、それら移動体通信端末に用いられるデバイスの技術的革新に寄与している。このようなＳＡＷデバイスは、移動体通信端末の小型化、高機能化を実現するためのキーパーツの１つと目され、主にＲＦ及びＩＦ段の帯域通過フィルタとして用いられ、フォトリソグラフィプロセスによって作製されるために、微細加工が可能であり、現在では数GHz帯でも実用化されている。
【００１３】
図１５（ａ）に上記ＳＡＷデバイス１の模式図を示す。このＳＡＷデバイス１では、表面弾性波４を励振し、且つ、受信するために圧電型基板３が用いられる。この圧電型基板３としては、弾性波の波長であるμｍオーダーの平滑性と、数１００ｐｐｍ以下の周波数の再現性を要求されることから、材料定数のばらつきが小さい圧電性単結晶や単結晶上に形成した圧電性薄膜などが使用される。表面弾性波４を励振する手段としては、図１５（ｂ）に示すようなプラス（＋）とマイナス（−）が交差し、所定のピッチ５を有して形成される櫛型電極（ＩＤＴ）２が用いられる。このＩＤＴ２に特有な周波数特性を用いることで、フィルタや共振子を構成することができる。
【００１４】
前記ＳＡＷデバイス１によって構成されるＳＡＷフィルタは、一般的に前記圧電型基板３と送受信用としてのＩＤＴ２によって構成されており、中心周波数ｆは表面弾性波の音速をv，ＩＤＴ２のピッチ５によって決まる波長をλとすると、f = v/λで表せる。したがって、この中心周波数帯が最もよく励振されるように設計することにより、任意の周波数帯を取り出すことが可能となる。このとき、さらに精度よく任意の周波数を得るためには、フィルタを数段使用する。図１６は、前記ＳＡＷフィルタを用いた携帯電話機の受信ブロックの一構成例を示す。アンテナ６から取り込まれた電波は、初段のＳＡＷフィルタ７ａを通過した後に、アンプ８、初段のミキサ９ａを通して周波数を落とし、さらに、次段のＳＡＷフィルタ７ｂから最終段のミキサ９ｂ、セラミックフィルタ１０を介してベースバンド部１１へ送られる。なお、符号１４はＶＣＯ、１２はＰＬＬシンセサイザ、１５はＴＣＸＯ、１３は局部発信器である。前記ＳＡＷフィルタ７ａ，７ｂは、カバーする周波数範囲が数１０MHz〜数GHzであるため、例えば、１．５GHzのデジタル携帯電話では、ＲＦの１．５GHz及び１３０MHzの初段ＩＦフィルタとして利用されている。
【００１５】
図１７は、前記ＳＡＷデバイス上にて細胞が伸展・移動する際に、ＳＡＷ伝搬経路に及ぶ応力を示した概念図である。ここで、（ａ）は細胞運動の直前の伸展・収縮力、（ｂ）は細胞運動後において、細胞１６の伸展・収縮力が細胞−基質間結合を介してＳＡＷ伝搬経路に応力１７を生じさせる様子を示した概念図である。前記細胞１６の基底面（細胞膜の培養基質に面する側を指す）上の接着受容体１８を経由して、接着斑１９（微小な接着領域を指す）のＳＡＷ伝搬経路基板面に応力１７が生じる。その際の伸展・収縮力２０を利用して細胞１６が伸展・移動するようになっている。
【非特許文献１】Multi-functionalSurface Acoustic Wave Sensor for Monitoring Environmental and StructuralCondition 、Y.Furuya, T. Kon T. Okazaki, Y. Saigusa and T.Nomura,On-line Proc. SPIE.vol.6170, 61700Q(2006) Q1-Q11
【非特許文献２】古屋、岡崎、野村、今、三枝、金属76-12(2006)pp.1286-1291
【非特許文献３】T.Nomura，A.Saitoh，Wireless acoustic wave sensor system，2002
【非特許文献４】Marc D.Schlensog,Thomas M.A. Gronewold, Michael Tewes,Michael Famulok, Eckhard Quandt:BIOSENSOR(2003)
【非特許文献５】持立克身、独立行政法人国立環境研究所、ＷＯ２００４／０８５６０６
【非特許文献６】今大健、弘前大学大学院前期課程(修士)論文(2006)
【非特許文献７】柴山乾夫、弾性波素子技術ハンドブック、1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従来のバイオ細胞センシング・評価技法としては、多くの場合、位相差または蛍光顕微鏡などの光学的観察や透過型または走査型電子顕微鏡による観察、生化学的・分子生物学的手法などを用いて、薬剤や毒性物質、環境因子等に対する細胞の増殖や壊死、形態、及び生化学的特徴などの変化を観察し、その変化から影響を検出・評価してきた。しかし、これらの手法は、観察用サンプル作製から結論を得るまでに時間を要するばかりでなく、人的労力や費用が増大する傾向にある。また、多サンプルを迅速・廉価に評価するには効率的ではない。さらに、細胞の増殖や移動における伸展や収縮に伴って基質に生ずる応力や、細胞−細胞間ないし細胞−基質間結合力、及び細胞内小器官を支える力学的構造などを、物理的観点から測定を試みた研究例はほとんどないのが現状である。
【００１７】
細胞センシング・評価技法は、細胞を培地（細胞が生育に必要な栄養液）中で培養しながら行われる事が多い、しかし、表面弾性波にレイリー波を選択した場合、変位は深さ方向（縦波）成分を持っているので溶液中で表面弾性波が大きく減衰する事が考えられる。よって、表面弾性波の減衰量がすくない表面波を選択する必要がある。
【００１８】
圧電型基板の材料は、圧電材料自体の温度係数によって、温度変化に対して敏感に反応してしまう傾向がある。しかし、表面弾性波の伝搬経路上に細胞を播種・培養し、表面弾性波を計測するに当たって、計測中の温度を一定に保っていても、僅かではあっても表面弾性波に影響を与える温度変化が起こることが想定される。この温度変化による信号変化を考慮する必要がある。
【００１９】
このような表面弾性波の伝搬経路上で細胞を培養するに当たって、デバイスの表面に直接細胞を播種・培養すると、細胞にとって圧電型基板が本来の接着基質でないことに起因する細胞と圧電型基板間の接着の不安定性や、細胞にとって毒性が危惧される圧電型基板の汚れなどによって、細胞が安定して培養できずに、表面弾性波の測定精度が確保できない可能性がある。そのため、信頼性を以して高感度に測定するためには、細胞−圧電型基板間の接着性を安定して高める技術を確立させる必要がある。
【００２０】
本発明では、圧電材料の表面付近にエネルギーを集中させて伝搬する表面弾性波デバイスにおいて、表面弾性波の伝搬経路上に細胞を播種・培養して構築した人工組織が、薬剤、毒性物質あるいは環境化学物質等の添加や機械的損傷によって、細胞伸展や収縮による応力、細胞−細胞間ないし細胞−基質間結合力、及び細胞内小器官を支える力学的構造に生ずる変化を、表面弾性波の伝搬特性の変化に着目して、高感度で計測できる表面弾性波デバイスバイオセンサを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記課題を解決するために、本発明の表面弾性波デバイスバイオセンサは、圧電型基板３に接合させたＩＤＴ２に高周波電流を流し、その圧電型基板３にＳＡＷ４を発生させ、そのＳＡＷ４の伝搬特性により、細胞伸展や収縮による応力、細胞−細胞間ないし細胞−基質間結合力、及び細胞内小器官を支える力学的構造、活動状態など細胞の物理的、化学的変化を検出することを特徴とする。
【００２２】
本発明の表面弾性波デバイスバイオセンサは、伝搬する表面弾性波成分が、水溶液中の伝搬損失の少ない完全水平せん断成分（shear-horizontal
）からなり、圧電型基板上に作製された人工組織に対して与えた損傷や生体影響が修復または回復する過程において、細胞が示す増殖や移動における伸展や収縮による応力、細胞−細胞間ないし細胞−基質間結合力、及び細胞内小器官を支える力学的構造、活動状態などの形質変化から検出すべく、表面弾性波伝搬特性の検出感度を向上させたことを特徴とする。
【００２３】
圧電型基板に接合させたＩＤＴからなる素子(デバイス)を２チャンネル化することで、１チャンネルを温度や溶液質量による受信信号変化を補正し、もう１チャンネルの細胞による物理的、化学的変化の信号受信を同時に抽出することによって、検出感度を向上させたことを特徴とする。
【００２４】
また、本発明の表面弾性波デバイスバイオセンサの伝搬経路上に細胞を定着・生育させるために、擬似マトリックス処理（持立克身、独立行政法人国立環境研究所、ＷＯ２００４／０８５６０６）を行った後に細胞を播種・培養することで、細胞と圧電型基板との接着性を高め、細胞に対する測定感度を向上させ、検出することを特徴とする。
【００２５】
表面弾性波の伝搬経路を１つのデバイス内に平面状のＸ座標軸用にＩＤＴを対向して単数もしくは多チャンネル配置させ、表面弾性波の伝搬経路上に細胞を播種・培養し、薬剤、毒性物質あるいは環境化学物質等による細胞の活性度、傷害修復や形質の変化を検出し、各チャンネルの信号変化を検出するせん断水平型表面弾性波デバイスからなる細胞活性度合いをリアルタイムで評価できることを特徴とする。
【００２６】
さらに、デバイスを平面状のＸ−Ｙ座標軸用に多チャンネル配置させ、Ｘ，Ｙ座標での対向する各ＩＤＴチャンネル間での表面弾性波の信号変化から、細胞の活性度、傷害修復や形質の変化をＸ−Ｙ画面上に画像処理により可視化を行い、環境因子の細胞活性度に及ぼす影響を視覚的にも迅速に診断評価ができることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
表面弾性波の伝搬経路に細胞を定着・生育させるために擬似マトリックス処理（持立克身、独立行政法人国立環境研究所、ＷＯ２００４／０８５６０６）を施し、且つ完全水平せん断成分からなるSH−ＳＡＷを用いることで培養液中での測定が可能となり、生きた状態で細胞の移動や増殖における伸展や収縮による応力、細胞−細胞間ないし細胞−基質間結合力、及び細胞内小器官を支える力学的構造、活動状態などの変化を、表面弾性波を用いて計測・評価することができる。
【００２８】
デバイス上に設置した複数のＩＤＴのパラメータセンシングを可能するように設計する。また、擬似マトリックス処理をした測定用チャンネルで表面弾性波の伝搬経路上に細胞を播種・培養して人工組織を構築した後、その人工組織に対して機械的損傷や薬剤による生体影響または健康影響を与える。その際にSH-ＳＡＷの変化を捉えることで、同時に複数の要因による圧電型基板上で培養した細胞ないし形成した人工組織への影響を計測することが可能になる。
【００２９】
ワイヤレス且つ無給電方式を採用することで、デバイスを培養装置に入れた状態で薬剤、化学物質や環境因子による細胞／組織への変化を測定するなど、測定の自動化や簡易化を行うことが出来る。また、装置全体の小型化にも寄与する。これによって、生体影響や健康影響、広くは毒性学及び薬理学の分野での細胞や組織への影響を、高感度でリモートセンシングでき、ワイヤレス化を行うことでよりコンパクトで軽量なバイオセンサシステムの基盤技術を研究開発し、将来の先端分析・計測機器に組み込むシステムに発展させることで技術的寄与度が実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
圧電型基板と櫛形電極から構成されたＳＡＷデバイスは、フォトリソグラフィによって小型化が可能になり、共振現象を用いた増幅器としてテレビ受信機や携帯電話などの通信用のデバイスへの製品開発がなされてきた。さらに、最近になってセンサ技術分野への適用性に関する研究がなされ、バイオ関係の研究も行われている。しかし、細胞生物学分野での研究例はほとんどないのが現状である。
【００３１】
本発明では、表面弾性波（ＳＡＷ）伝搬特性の変化に着目し、このＳＡＷによる伝搬経路上に細胞を培養し、薬理学的・毒性学的・健康影響等様々な要因による細胞や組織に対する影響を、主として機械的な観点から測定できる小型人工組織ＳＡＷセンシングシステムへの基盤技術に発展させることができる。図１は本発明の人工組織によるＳＡＷデバイスバイオセンサ（以下、ＳＡＷデバイスセンサという）の概略構成図を示したものである。
【００３２】
このＳＡＷデバイスセンサ２１は、圧電型基板２２上に櫛型電極（ＩＤＴ）２３を形成し、このＩＤＴ２３に外部から高周波電流または高周波電圧を印加させることによって、圧電型基板２２上に表面弾性波（ＳＡＷ）２５を生じさせる。また、このＳＡＷ２５による伝搬経路（以下、ＳＡＷ伝播経路）２４上には、擬似マトリックス２７の処理を行った後に細胞を培養する。この擬似マトリックス２７は、培養細胞２８と圧電型基板２２の接着性を高める役割を果たし、薬物、環境化学物質（重金属、酸化性物質、塩素有機化合物、環境ホルモンなどの毒性物質）などによる生化学的変化や機械的損傷による傷害とその修復過程における圧電型基板２２に及ぼす応力の変化など、複数の外部要因による影響を検知（センシング）を行うことが可能となる。なお、符号２６はＩＤＴ２３上を被うSiO2薄膜である。
【００３３】
また、１チャンネルを参照用に用いることで、培養中の微小な温度変化による測定誤差を減少させることができる。本実施形態のＳＡＷデバイスセンサ２１は、ＳＡＷ伝搬経路２４を２チャンネル備えているが、これには限定されず、さらにチャンネル数を増やすことによって、１チップで高精度の測定を実現することが可能である。
【００３４】
前記ＳＡＷデバイスセンサ２１は、フォトリソグラフィ工程によって作製されるため、小型化が容易で安価であり、その周波数特性はＩＤＴ２３の線状電極の間隔によって決定される。このため、微細加工技術の発達とともに高周波化され、バイオセンサ等でのより高度なセンシングが可能となる。
【００３５】
前記ＳＡＷデバイスセンサ２１の設計・試作では、寸法8mm×10mmのLiTaO3（42°Y-Xカット）の圧電型基板２２を用いた。溶液中で測定する必要があるため、水中での伝搬損失の少ないSHモードを有する圧電型基板２２を選択した。表２に示すように、前記圧電型基板２２に形成されるＩＤＴ２３にはAuを用い、P（ピッチ）10μm、交差幅3mm、伝搬距離4mmとなるようにフォトリソグラフィにより製作した。中心周波数をオシロスコープで測定したところ、108MHzであった。図２（ａ）は実際に設計をおこなったＳＡＷデバイスセンサ２１の形状及び各部の寸法を示したものであり、図２（ｂ）は前記ＳＡＷデバイスセンサ２１を２チャンネル搭載した２ｃｈ型ＳＡＷデバイスセンサの概観を示したものである。
【００３６】
【表２】
【００３７】
測定の際、ＳＡＷデバイスセンサ２１全体を溶液に浸して行うことになるため、ＩＤＴ２３と配線部に絶縁処理を施した。前記ＩＤＴ２３上をSiO2薄膜で被い、それ以外の部分はシリコーン系樹脂であるＰＤＭＳを用いて絶縁を行った。また、ＩＤＴ２３上にSiO2薄膜を成膜する方法として、マグネトロンスパッタ法を用い、基板温度40℃，真空度1.5×10−4Pa，アルゴン圧4.0Pa中で行った。薄膜の厚さは400nmとなるようにした。図３はマグネトロンスパッタ法による装置構成示したものである。このマグネトロンスパッタ法では、最初に真空ポンプ３７によってチャンバ３８内を真空状態にする。次に、ターゲット３５の中心と外周を結ぶ漏れ磁界を発生させ、アルゴンガス３１のような不活性ガスに高周波電源３６を用いて高電圧を印加し、グロー放電を発生させることで、イオン化したアルゴンガス３１をターゲット３５に衝突させてその一部を弾き飛ばす。その際、チャンバ３８内のシャッタ３４を操作することにより、基盤３３にターゲット３５を組成とする薄膜を得ることができる。この時、ヒータ３２を使用することで任意の温度にて薄膜を形成することができる。また、前記ＰＤＭＳは、伝搬部以外の全体にコーティングをし、８０℃に設定した高温槽で約１時間保温することで硬化させた。ＰＤＭＳは、細胞に対しての毒性がないことを確認し用いた。
【００３８】
結線方法は、ポリマー基板上に銅箔を貼り付けたものにエッチングを行い、銅箔を任意の形にした。次に、試作したＳＡＷデバイスセンサ２１をポリマー基板中央に固定し、銅テープにてポリマー基板上の銅箔とＳＡＷデバイスセンサ２１の配線を行い、それぞれの結合部に電気の流れを良くするために導電性接着剤（ドウタイト）を塗った。
【００３９】
本発明では、圧電型基板２２上で細胞を直接培養するのではなく、細胞接着性を向上させるために擬似マトリックスコーティング処理をした。このＳＡＷデバイスセンサの表面に細胞を培養する技術は、国立環境研究所の持立博士が開発した技術を利用した（持立克身、独立行政法人国立環境研究所、ＷＯ２００４／０８５６０６）。この技術を用いることで、ＳＡＷ伝搬経路における細胞の接着性が高まり、細胞による変化をＳＡＷの変化として高感度に捉えることができる。
【００４０】
測定に利用した回路を図４に示す。入力信号であるトーンバースト波４４は、基準信号発生器４２からの連続波をパルスジェネレータ４１からの信号とミキサ４３を用いて乗算することにより得る。この時、基準信号発生器４２からの連続波の周波数は中心周波数である１０８ＭＨｚである。この基準信号発生器４２からの連続波の一部をデジタルオシロスコープ４８に参照波４７として入力した。受信部ではセンサデバイス４５からアンプ４６を通した出力信号と参照波との位相差を計測していくことにより、ＳＡＷの伝搬速度の変化として計測を行った。
【００４１】
図５は、図１に示したＳＡＷデバイスセンサ２１上の培養細胞２８に欠損部２９が生じた場合の概念図であり、図６は、前記培養細胞２８の進展を測定するための手順を示す説明図である。図６に示されるように、前記培養細胞２８は、時間軸と強度軸とによる測定波形５１によって進展状態が測定される。次に、データ解析・画像表示部５２によって前記測定波形５１が画像化５３される。この画像化５３によれば、培養細胞２８のおける傷３０の位置や大きさとともに、矢線で示すような収縮力５４がどのように作用しているかがイメージとして確認することができる。
【００４２】
以下、前記ＳＡＷデバイスセンサ２１による細胞の培養状態を測定するための条件について説明する。２型肺胞上皮細胞（以下、Ｔ２細胞と略す。）（文献：Clement et al.
SV40T-immortalized lung alveolar epithelial cells. Exp. Cell Res.
196: 198-205, 1991）の有無によりどのような変化が起こるかを測定するため、培養前、培養１日後（２４時間後）、培養２日後（４８時間後）で測定した。また、細胞の培養状態の違いによるＳＡＷの変化を見るため、ＳＡＷの伝搬面上に培養したＴ２細胞に対して、機械的損傷又は化学的損傷を与えて測定した。
【００４３】
機械的損傷として、先端が細く絞られたプラスチック製の棒を用いて、ＳＡＷの伝搬方向と垂直に、５００μｍ程度の幅で直線状に傷をつけ、ＳＡＷの変化を測定した。化学的損傷として、カルシウムキレート剤ＥＤＴＡによる処理をおこない、Ｔ２細胞間の結合を低下させることによるＳＡＷの変化を測定した。
【００４４】
（細胞培養による細胞有無の測定）
細胞培養前後におけるＳＡＷの遅延時間変化を図７に示す。このグラフでは、細胞培養前の遅延時間を基準とし、基準からの変化を表している。その結果は、培養後は遅延時間が減少しており、伝搬速度が速くなっていることを示す。音波の弾性率と密度との関係式（数１）から、水と細胞のＥとρを比較した場合に、Ｅは水より細胞が高いのに対してρは水：1、細胞：１．０１でほとんど差がない。これにより、細胞を培養したことによる弾性率の変化のみが作用したと考えられる。
【００４５】
【数１】
【００４６】
また、培養１日と２日では細胞の平面密度や結合の程度が上がったため、Ｅが増加し変化が大きくなったと考えられる。細胞が培養されていることを確認するため、反射型微分干渉顕微鏡で撮影した。図８にＳＡＷ上での細胞の培養前（ａ）と培養後（ｂ）の写真を示す。培養前の圧電型基板には何もないのに対して、培養後は圧電型基板全体に細胞が生育しているのが確認できた。
【００４７】
擬似マトリックス処理を施した圧電型基板上でＴ２細胞を培養し、全面に亘って細胞が進展・生育した後に、細胞を５００μｍ程度の幅で直線状に機械的に剥離した。この処理前後のＳＡＷの変化を図９に示す。細胞培養２日目において、細胞を剥離する直前のＳＡＷの変化量１００％とし、細胞を剥離した直後のＳＡＷ変化量と比較した。この結果から、ＳＡＷ伝搬経路と直角に細胞を一定の幅で剥離することで、ＳＡＷの変化量が減少し、細胞が無い状態でのＳＡＷの速度に近づいている。ＳＡＷ伝搬経路に対して細胞の占有する面積が減少したことで、ＳＡＷの変化率が減少し、細胞の無い場合に近づいたと考えられる。
【００４８】
即ち、溶媒よりも高い剛性（弾性率）を有する細胞が一部除去されることで、ＳＡＷ伝搬経路上での全体の弾性率が低下した。このことにより、ＳＡＷの音速が遅くなり細胞が無い場合に近づいたことで、変化率が減少したと考えられる。図１０（ａ）に、Ｔ２細胞を直線的に剥離した状態の反射型微分干渉顕微鏡写真を示す。
【００４９】
図１１に、カルシウムキレート剤ＥＤＴＡによる処理時間とＳＡＷ信号の変化をグラフで示す。培養２日目におけるＥＤＴＡ処理前のＴ２細胞によるＳＡＷ遅延の変化量を１００％とし、１０ｍＭ ＥＤＴＡ添加後のＳＡＷの変化量を時間経過とともに測定した。このグラフから、ＥＤＴＡ処理を行うことにより、ＳＡＷ伝搬経路上で培養したＴ２細胞によるＳＡＷの変化量が減少していることが示されている。処理開始からほぼ１０分で変化が収束しているのは、カルシウムキレート剤による効果が収まったためと考えられる。
【００５０】
図１０（ｂ）に、ＥＤＴＡ処理をしたＴ２細胞の反射型微分干渉顕微鏡写真を示す。この写真からも、細胞−細胞間結合が切れ、全体のＴ２細胞培養量が低下していることが確認できた。化学的処理の場合、前出の機械的損傷と較べて、細胞の培養面積の減少に加え、細胞−細胞間結合力の低下による影響も協奏し合って、ＳＡＷ信号が変化したと考えられる。
【００５１】
上記より、今回の実験では、
（１）ＳＡＷ伝搬経路表面上の細胞の有無（培養時間の違い）によってＳＡＷの伝搬速度が変化したことより、細胞の培養状態を観測しながら測定することが可能である。
（２）ＳＡＷ伝搬経路表面全体に亘って培養した細胞に、機械的損傷として伝搬経路と直角に直線状の傷をつける、細胞−細胞間結合を化学的処理で弱める（切り離す）などの処理による細胞状態の変化を、処理前の信号と比較することで影響の度合いを測定することができた。このことから、人工組織によるＳＡＷデバイスセンサの有効性を確認できた。
【００５２】
本発明のＳＡＷデバイスセンサによるシステムを一層発展させ、センサデバイスとしての信頼性、汎用性を高めるには、圧電型基板となる高感度で低温度係数の圧電材料の選択、ＩＤＴ高密度化による細胞個々の変化を高感度に測定し、測定チャンネルを増やすことによる高精度化を計り、無線技術を適用することによるシステムの簡素化などを行う必要がある。また、センサとしての価値を高めるために、細胞−細胞間結合力と細胞全体の弾性率の変化、密度因子、弾性率と密度以外の因子である細胞形態や内部構造の影響の測定、細胞の活動状態の可視化などがあげられる。
【００５３】
表面弾性波の伝搬経路を１つのデバイス内に平面状のＸ座標軸用にＩＤＴを対向して単数もしくは多チャンネル配置させ、表面弾性波の伝搬経路上に細胞を播種・培養し、薬剤や毒性物質、環境因子等による細胞の活性度、傷害修復や形質の変化を検出し、各チャンネルの信号変化を検出するせん断水平型表面弾性波デバイスからなる細胞活性度合いをリアルタイムで評価できる。
【００５４】
さらに、図１２に示されるように、デバイスをＸ発信子６２からなるＸ側ＳＡＷ反射アレイ６４及びＹ発信子６３からなるＹ側ＳＡＷ反射アレイによって構成される平面状のＸ−Ｙ座標軸用に多チャンネル配置させ、Ｘ，Ｙ座標での対向する各ＩＤＴチャンネル間でのＸ側伝播経路６６及びＹ側伝播経路６７を伝播するＳＡＷの信号変化から、細胞６１の活性度、傷害修復や形質の変化をＸ−Ｙ画面上に画像処理により可視化を行い、薬剤や毒性物質、環境因子等の細胞活性度に及ぼす影響を視覚的にも迅速に診断評価ができる。
【００５５】
これらの技術課題を改善することで、薬理学・毒性学的研究分野、環境問題に関連する生体影響研究分野におけるモデル実験やフィールド調査等での細胞又は人工組織への影響を、高感度でリモートセンシングでき、ワイヤレス化によってコンパクトで軽量なＳＡＷデバイスセンサシステムの基盤技術を研究開発し、将来の先端分析・計測機器に組み込むシステムに発展させることで、技術的貢献ができる。
【００５６】
本発明の技術的および社会的意義、活用分野は以下の通りである。
本発明は、細胞や組織に与える薬理学的、毒性学的影響や環境因子による生体影響をリアルタイムで検出（センシング）・評価する新技術開発に関する。計測の近距離無線（ワイヤレス）化が可能で、多数サンプルを迅速に計測可能で、本発明の人工組織によるＳＡＷデバイスセンサの社会的意義や活用分野は、薬理学的、毒性学的研究において従来にはなかった新たな指標からの影響評価、ウイルス性疾患による感染の流行を早い段階で感知・警報するシステム、アレルギー性疾患（花粉症など）さらには、超高感受性細胞を利用したバイオテロ警報システムなどへの応用も期待できる。以下にその意義と分野を列記する。
（１）生体センシング技術の発展
（２）表面弾性波デバイスバイオセンサの提案
（３）細胞の力学的構造解析技術の発展
（４）細胞培養・固定技術
（５）安全対策における、バイオテロ対策技術の発展
（６）生体センシング関連における評価工程の簡易化・低コスト化
（７）医療分野開発における検査および評価技術の発展
（８）健康管理システム技術
（９）安心・安全社会への寄与
そして、国際的に独自で優位な先端計測分析技術・手段として発展・確立させる事ができる。
【００５７】
本発明の人工組織によるＳＡＷデバイスセンサの具体的適用分野としては、以下に示すようなものが考えられる。
（１）細胞の機械的要素（細胞−細胞間または細胞−基質間結合力、弾性率、密度因子、細胞内部の応力）の測定。
（２）多チャンネル応用（Ｘ−Ｙ）による、細胞形態変化の画像描画システム。
（３）画像描画システムによる、細胞や組織の傷害修復過程などでの機械的要素（細胞−細胞間または細胞−基質間結合力、弾性率、密度因子、細胞内部の応力）の分布状態の計測。
（４）細胞や組織の活動度レベルを検知することで、環境因子に対するリアルタイム検出・評価。
（５）多チャンネル化により各種化学反応膜を複合利用し、イオン分極化、粘性変化、減衰性変化を組み合わせた、生体酵素反応、細菌、各種ウイルスの総合反応検知。
（６）細菌管理システムでのバイオハザード対策検知。
（７）細胞を利用した微量成分センシングによるバイオテロ対策検知。
（８）小型化による生体影響や健康影響のリアルタイム計測。
（９）新薬剤開発におけるリアルタイムでの薬理効果や副作用の検知および評価。
- 【公開番号】特開２００９−２６７７（Ｐ２００９−２６７７Ａ）
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【発明の名称】表面弾性波デバイスバイオセンサ
【発明者】
【氏名】持立 克身
【氏名】古屋 泰文
【氏名】細川 直裕
【氏名】林 芳幸
【氏名】三枝 康孝
【氏名】今 大健
- 【出願番号】特願２００７−１６１３１２（Ｐ２００７−１６１３１２）
【出願日】平成１９年６月１９日（２００７．６．１９）
【出願人】
【識別番号】５０４２２９２８４
【氏名又は名称】国立大学法人弘前大学
【識別番号】５０３１０８８８３
【氏名又は名称】持立 克身
【識別番号】０００２３７４４４
【氏名又は名称】リバーエレテック株式会社
- 【代理人】
【識別番号】１０００９７０４３
【弁理士】
【氏名又は名称】浅川 哲
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